本文關(guān)鍵詞：口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3D的分段表達(dá)及其免疫學(xué)功能研究　出處：《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。一旦發(fā)生疫情損失重大，影響惡劣。應(yīng)用疫苗進(jìn)行免疫接種是預(yù)防、控制乃至消滅FMD的有效手段之一。由于目前使用的滅活疫苗存在諸多缺點(diǎn)，發(fā)達(dá)國(guó)家曾一度停止了該疫苗的使用。近年來(lái)出現(xiàn)了多種新型高效FMD分子疫苗，但低免疫原性仍然是制約FMD分子疫苗發(fā)展的技術(shù)瓶頸。本研究以本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)一步研究FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3D的免疫增強(qiáng)功能，為研制高效、安全的FMD新型分子疫苗提供理論依據(jù)。 首先采用生物信息學(xué)軟件對(duì)Asia1型FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3D的T細(xì)胞表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)，根據(jù)T細(xì)胞表位富集度，，將3D基因分成三段，并設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并實(shí)現(xiàn)重組蛋白3D1，3D2和3D3在大腸桿菌細(xì)胞BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)及純化。重組蛋白3D1，3D2和3D3定量后分別與等體積的佐劑混合乳化；或分別與表達(dá)的Asia1型FMDV多表位重組按照1：2(w/w)混合，并與等體積佐劑混合乳化制備成疫苗。用間接ELISA，流式細(xì)胞術(shù)、淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)以及ELISPOT等對(duì)免疫小鼠血清抗體、脾淋巴細(xì)胞增殖能力以及關(guān)鍵細(xì)胞因子表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。Western blotting結(jié)果顯示3D1重組蛋白不能與FMDV陽(yáng)性血清發(fā)生免疫反應(yīng)外，其他2種蛋白均能與陽(yáng)性血清發(fā)生免疫反應(yīng)。但三種蛋白都能與抗His單抗發(fā)生免疫反應(yīng)。免疫小鼠血清抗體隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)升高，且3D2或3D3與Asia1型FMDV表位重組抗原聯(lián)合免疫優(yōu)于3D1與Asia1型FMDV表位重組抗原。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，3D1與Asia1型FMDV表位重組抗原優(yōu)于3D2或3D3與Asia1型FMDV表位重組抗原聯(lián)合免疫。ELISPOT結(jié)果表明，重組蛋白3D1，3D2和3D3分別與表位重組抗原組合，分泌IFN-γ的脾淋巴細(xì)胞顯著高于Asia1型FMDV多表位重組抗原單獨(dú)免疫組，但遺憾的是，分泌IL-4細(xì)胞因子的淋巴細(xì)胞各組差異不顯著。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證三個(gè)蛋白的免疫功能，將重組蛋白3D1，3D2和3D3分別與表達(dá)的Asia1型FMDV多表位重組按照1：2(w/w)混合或者單獨(dú)Asia1型FMDV多表位混合制備的疫苗免疫豚鼠，并于加強(qiáng)免疫后14天用500ID50/0.2ml的Asia1型FMDV攻擊實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，結(jié)果顯示，重組蛋白3D1、3D2和3D3分別與Asia1型FMDV多表位重組抗原聯(lián)合免疫組中均有3/4（75%）完全保護(hù)，而Asia1型FMDV多表位重組抗原單獨(dú)免疫組只有2/4動(dòng)物（50%）完全保護(hù)。 為了驗(yàn)證三個(gè)蛋白對(duì)O型FMDV多表位重組抗原的免疫調(diào)節(jié)功能，將3D1、3D2和3D3分別與豬O型FMDV廣譜多表位重組抗原聯(lián)合或單獨(dú)3D蛋白免疫豬。液相阻斷ELISA（LPB-ELISA）結(jié)果顯示，在首免后17天，與O型FMDV廣譜多表位重組抗原單獨(dú)免疫組相比，添加3D1、3D2和3D3的均能產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，但加強(qiáng)免疫后所有組別間抗體水平?jīng)]有明顯的差異。 綜上所述，本研究表明表達(dá)的三個(gè)蛋白，尤其是3D1和3D3，不僅能夠改善FMDV表位重組抗原的免疫原性，而且能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，是一種很好的疫苗佐劑。
[Abstract]:Foot - and - mouth disease ( FMDV ) is an acute , hot and highly contagious disease caused by Foot - and - mouth disease virus ( FMDV ) . It is one of the most effective ways to prevent , control and eliminate the disease . The recombinant protein 3D1 , 3D2 and 3D3 were combined with the recombinant antigen of FMDV . The results showed that the recombinant proteins 3D1 , 3D2 and 3D3 were combined with the recombinant antigen of FMDV . The results of Western blotting showed that the recombinant proteins 3D1 , 3D2 and 3D3 could not react with the recombinant antigen of FMDV epitope . The results showed that the recombinant proteins 3D1 , 3D2 and 3D3 were significantly higher than those of Asia1 type FMDV epitope . In order to further verify the immune function of the three proteins , the recombinant proteins 3D1 , 3D2 and 3D3 were mixed with the expressed Asia1 type FMDV multi - epitope recombination according to 1 : 2 ( w / w ) or single Asia1 type FMDV multiple epitopes . The results showed that the recombinant proteins 3D1 , 3D2 and 3D3 were completely protected by 3 / 4 ( 75 % ) of the Asia1 type FMDV multi - epitope recombinant antigen combined immunization group , and only 2 / 4 animals ( 50 % ) in the Asia1 type FMDV epitope recombinant antigen were completely protected . In order to verify the immunoregulatory function of three proteins against O - type FMDV multi - epitope recombinant antigen , 3D1 , 3D2 and 3D3 were respectively combined with porcine O - type FMDV broad - spectrum multi - epitope recombinant antigen or single 3D protein immunized pigs . In conclusion , the three proteins expressed in this study , especially 3D1 and 3D3 , can not only improve the immunogenicity of FMDV epitope recombinant antigen , but also induce cellular immune response , which is a good vaccine adjuvant .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1403978