本文關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸二甲酯人工抗原包被的酶聯(lián)免疫分析法的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：鄰苯二甲酸二甲酯(Dimethylphthalate, DMP),是鄰苯二甲酸酯類化合物中的一種,主要作為增塑劑應(yīng)用于食品包裝、醫(yī)療設(shè)備、建筑裝修材料以及家庭生活用品中。隨著增塑劑的廣泛使用,DMP被大量釋放出來(lái)進(jìn)入環(huán)境。環(huán)境中的DMP可通過(guò)呼吸或飲食等方式被人體吸收。研究發(fā)現(xiàn)：DMP對(duì)人體健康具有毒性作用,已被我國(guó)列為優(yōu)先控制的環(huán)境污染物。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)DMP的檢測(cè)方法主要有氣相色譜(Gas chromatography, GC)、高效液相色譜(High performance liquid chromatography, HPLC)和氣相色譜-質(zhì)譜(Ga schromatography-mass spectrometry, GC-MS)聯(lián)用技術(shù),這些方法都能精確地檢測(cè)出DMP的含量,但樣品前期處理操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng),需要高檔的儀器設(shè)備,不便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。為方便測(cè)定DMP在環(huán)境中的污染水平,建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、低成本的方法檢測(cè)環(huán)境和生活用品中DMP的含量具有重要的科學(xué)意義。酶聯(lián)免疫分析(Enzyme-linked immmosorbent assay, ELISA)具有操作簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、不需昂貴的儀器設(shè)備、可在現(xiàn)場(chǎng)一次檢測(cè)多個(gè)樣本等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)環(huán)境污染物的經(jīng)典方法。本研究采用重氮法將小分子化合物4-氨基鄰苯二甲酸二甲酯(Dimethyl-4-amino phthalate, DMAP)與牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)和卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)進(jìn)行偶聯(lián)合成人工抗原DMAP-BSA和DMAP-OVA。通過(guò)篩選,選用DMAP-BSA作為免疫原免疫Balb/c小鼠。6次免疫結(jié)束后,獲得高效價(jià)和高靈敏度抗血清。采用雜交瘤技術(shù)融合免疫效果最佳小鼠的脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞,通過(guò)ELISA法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞陽(yáng)性和對(duì)DMP的特異性,篩選出一株能穩(wěn)定分泌DMP單克隆抗體細(xì)胞株DMP-2C11,夾心ELISA法檢測(cè)出DMP-2C11細(xì)胞株分泌抗體的亞型是IgG2ao DMP-2C11細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后,通過(guò)小鼠腹水法大量制備DMP的單克隆抗體,辛酸-硫酸銨法提純腹水抗體,方陣滴定法確定最佳人工抗原包被濃度為0.5μg/mL,單抗最佳稀釋倍數(shù)為4000。ELISA最適檢測(cè)條件：5%脫脂奶粉作封閉劑、二抗反應(yīng)溫度為37℃,鄰苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)作顯色劑。建立的人工抗原包被的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線y=19.68Log(x)+20.71,相關(guān)系數(shù)R2為0.993,線性檢測(cè)范圍是0.92～1029.68μg/L,最低檢測(cè)限(LD)即IC1o為0.28μg/L,表明該DMP抗體可滿足環(huán)境中DMP含量的檢測(cè)。
【關(guān)鍵詞】：鄰苯二甲酸二甲酯(DMP) 人工抗原 雜交瘤 酶聯(lián)免疫分析(ELISA)
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：X830.2
【目錄】：

• 摘要6-7
• Absract7-11
• 1. 緒論11-19
• 1.1 鄰苯二甲酸二甲酯的性質(zhì)及應(yīng)用11
• 1.2 環(huán)境中的鄰苯二甲酸二甲酯11-12
• 1.2.1 大氣環(huán)境中11-12
• 1.2.2 土壤環(huán)境中12
• 1.2.3 水體環(huán)境中12
• 1.3 鄰苯二甲酸二甲酯的危害12-13
• 1.4 PAEs的檢測(cè)方法13-16
• 1.4.1 色譜法(Chromatography)13-15
• 1.4.2 免疫分析法(IA)15-16
• 1.4.3 生物素-親和素放大酶聯(lián)免疫分析(BA-ELISA)16
• 1.5 小分子的酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(ELISA)16-18
• 1.5.1 人工抗原制備16-17
• 1.5.2 單克隆抗體制備17-18
• 1.6 研究目的及意義18-19
• 2. 材料與方法19-32
• 2.1 材料、試劑與儀器19-22
• 2.1.1 材料19
• 2.1.2 主要試劑19
• 2.1.3 主要溶液19-22
• 2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-32
• 2.2.1 人工抗原合成22-23
• 2.2.2 人工抗原純化23
• 2.2.3 人工抗原蛋白含量測(cè)定23-24
• 2.2.4 人工抗原結(jié)構(gòu)鑒定24
• 2.2.5 Balb/c小鼠的免疫24
• 2.2.6 ELISA方陣滴定24-25
• 2.2.7 抗血清效價(jià)測(cè)定25
• 2.2.8 抗血清靈敏度測(cè)定25-26
• 2.2.9 單克隆抗體制備26-29
• 2.2.10 雜交瘤細(xì)胞染色體分析29
• 2.2.11 單克隆抗體亞型分析29-30
• 2.2.12 單克隆抗體純化30
• 2.2.13 優(yōu)化ELISA檢測(cè)條件30-32
• 3. 結(jié)果與分析32-45
• 3.1 人工抗原鑒定32-34
• 3.1.1 UV掃譜鑒定32-33
• 3.1.2 SDS-PAGE鑒定33-34
• 3.2 人工抗原含量測(cè)定34
• 3.3 ELISA法方陣滴定34-35
• 3.4 測(cè)定抗血清效價(jià)35-36
• 3.5 抗血清靈敏度測(cè)定36
• 3.6 細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)36-37
• 3.7 雜交瘤細(xì)胞克隆化37-38
• 3.8 雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)38
• 3.9 雜交瘤染色體分析38-39
• 3.10 單克隆抗體亞型分析39
• 3.11 單克隆抗體的純化39-40
• 3.12 人工抗原包被的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立40-45
• 3.12.1 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA條件優(yōu)化40-43
• 3.12.2 建立人工抗原包被的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線43-45
• 4. 討論45-49
• 4.1 鄰苯二甲酸二甲酯人工抗原的合成45
• 4.2 免疫方案的確定45-46
• 4.3 單克隆抗體制備46-48
• 4.3.1 細(xì)胞融合46
• 4.3.2 雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)46-47
• 4.3.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選47
• 4.3.4 雜交瘤細(xì)胞克隆化47
• 4.3.5 雜交瘤細(xì)胞凍存與復(fù)蘇47
• 4.3.6 單克隆抗體純化47-48
• 4.4 反應(yīng)條件對(duì)人工抗原包被間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的影響48
• 4.5 間接ELISA檢測(cè)注意事項(xiàng)48-49
• 5. 結(jié)論與展望49-50
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 附錄1 主要英文縮寫詞55-56
• 附錄2 攻讀學(xué)位期間論文發(fā)表情況56-57
• 致謝57

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：278899