基因工程制藥工藝ppt
本文關(guān)鍵詞：基因工程，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
這是一個關(guān)于基因工程制藥工藝ppt，主要介紹了6.1 基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)。6.2 基因工程大腸桿菌的構(gòu)建。6.3 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制等等內(nèi)容。歡迎點擊下載！
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第六章 基因工程制藥工藝
6.1 基因工程制藥微生物表達系統(tǒng)
6.2 基因工程大腸桿菌的構(gòu)建
6.3 基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制
基因工程藥物研究的技術(shù)路線-上游技術(shù)
基因工程藥物涉及的技術(shù)
RNA提取及操作, 防RNA酶
引物設(shè)計
cDNA合成
PCR
質(zhì)粒提取
限制性內(nèi)切酶操作
DNA連接
制備大腸桿菌感受態(tài)細胞
轉(zhuǎn)化大腸桿菌
無菌操作
制備各種培養(yǎng)基
基因工程菌
概念：以微生物為操作對象，通過基因工程技術(shù)獲得的表達外源基因，或過量表達或抑制自身基因的工程生物體。
種類：
基因工程大腸桿菌和酵母：重組蛋白質(zhì)藥物
基因工程技術(shù)改造出發(fā)菌：氨基酸、抗生素、甾體激素、中間體生產(chǎn)
6.1.1 大腸桿菌系統(tǒng)
1、大腸桿菌（Escherichia coli）形態(tài)特征
細胞：G-，單細胞，桿狀，鞭毛，無芽孢，一般無
莢膜。裂殖。
菌落：白色至黃白色，光滑，直徑2~3mm
2、生化與遺傳特性
能在僅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的無機鹽的極限培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵糖，產(chǎn)氣、產(chǎn)酸。
繁殖一代約17min
基因工程中使用菌株：K-12株的衍生菌株
基因組：4.6 Mbp，3000多種蛋白質(zhì)
染色體DNA為環(huán)狀雙鏈，核外遺傳物質(zhì)為質(zhì)粒
3、質(zhì)粒載體
質(zhì)粒載體的基本特征
自主復(fù)制性：復(fù)制子—復(fù)制起始點及控制復(fù)制頻率的調(diào)控元件。質(zhì)粒DNA不依賴于染色體DNA而自主復(fù)制。
選擇標記：質(zhì)粒編碼的選擇標記，產(chǎn)生一種新的表型，用于轉(zhuǎn)化體的篩選。如：抗生素抗性基因，氨芐、四環(huán)素、卡那等。
多克隆位點：外源基因插入載體的位置，由多種常見的限制性內(nèi)切酶位點序列構(gòu)成。
不相容性：具有相同或相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)及特征的兩種不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定地存在于同一宿主細胞內(nèi)。
轉(zhuǎn)移性：通過細菌接合作用從一個宿主轉(zhuǎn)移到另一個宿主細胞/菌
質(zhì)粒類型
嚴謹型質(zhì)粒：每個細胞含少數(shù)拷貝質(zhì)粒
松弛型質(zhì)粒：每個細胞含幾十至幾百拷貝質(zhì)粒
克隆質(zhì)粒：用于克隆和擴增外源基因
測序質(zhì)粒：用于基因測序
整合質(zhì)粒：用于外源基因與宿主染色體整合
穿梭質(zhì)粒：能在兩種宿主細胞存在
表達質(zhì)粒：能表達基因產(chǎn)物
表達載體MCS附近結(jié)構(gòu)
4、產(chǎn)物表達形式
不溶性蛋白質(zhì)：細胞質(zhì)內(nèi)形成包涵體
可溶性蛋白質(zhì)：存在于細胞質(zhì)
周質(zhì)表達：外源蛋白被運輸分泌到周質(zhì)空間，可溶性
胞外表達：胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)液中
6、應(yīng)用
大量外源基因能超量的表達，，18種藥物上市
多肽類：2種（甲狀旁腺激素1-34、利尿鈉肽）
激素：胰島素及2種突變體、8種生長素（1種PEG化）
細胞因子類：5種干擾素α（1種PEG化）、干擾素β和γ，2種G-CSF（1種PEG化）、白介素-2、白介素-11、白介素-1拮抗劑
溶栓酶類：rPA（reteplase，瑞替普酶）
白喉毒素-1L 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗）等
6.1.2 酵母表達系統(tǒng)
2、生長與遺傳特征
兩個性別不同的單倍體細胞結(jié)合形成二倍體結(jié)合子或營養(yǎng)細胞，進行芽殖。
能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖等。
生長繁殖迅速，倍增期約2 h
釀酒酵母有17條染色體
1996年完成其全基因組測序，遺傳背景相對清楚
基因組：120.68 Mbp，5887個ORF，編碼約6000個基因
表達載體—穿梭載體
含有復(fù)制起始序列或整合序列、選擇標記以及由啟動子、終止子和信號肽序列構(gòu)成的表達盒序列。
四種類型
YIp酵母整合載體
YCp酵母著絲粒載體
YRp酵母復(fù)制載體
YEp酵母附加載體
YIp酵母整合載體：選擇標記和MCS，無自主復(fù)制序列，有整合序列。同源重組整合到酵母染色體，隨同染色體一起復(fù)制和遺傳。
YCp酵母著絲粒載體：著絲粒序列和自主復(fù)制序列�？勺灾鲝�(fù)制，拷貝數(shù)很低，無選擇性，極易丟失，主要用于文庫構(gòu)建和基因克隆。
YRp酵母復(fù)制載體：酵母基因組DNA復(fù)制序列，可獨立自主復(fù)制，轉(zhuǎn)化效率高。但存在分配不均一性，母細胞中遠遠多于子細胞中。無選擇壓，容易丟失。常用于試驗研究，很難工業(yè)化應(yīng)用。
YEp酵母附加載體：復(fù)制子，可自主復(fù)制，高拷貝，轉(zhuǎn)化頻率高。改造后，無需選擇壓就能高拷貝穩(wěn)定分配，在大規(guī)模無選擇培養(yǎng)中是非常有用的，用于過量表達外援基因。
3、優(yōu)點與不足
載體：安全、無毒
營養(yǎng)缺陷選擇外來質(zhì)粒
培養(yǎng)條件簡單，大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成熟
亞細胞器分化，進行蛋白質(zhì)的翻譯后正確修飾和加工，并具有良好的蛋白質(zhì)分泌能力
缺點：
釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，制約了高密度發(fā)酵
修飾的蛋白質(zhì)糖基化側(cè)鏈過長，會引起副作用
4、應(yīng)用
1981年，Nature，Hitzeman等在酵母中表達人干擾素
激素類：67種人胰島素及1種突變體，尿酸水解酶和水蛭素
細胞因子：GM-CSF和血小板衍生生長因子
多肽類：高血糖素
2種乙肝疫苗等
Pichia pastoris 表達系統(tǒng)
Pichia pastoris 是甲醇利用型酵母,可以用甲醇作為唯一的碳源；
易操作，培養(yǎng)容易；
表達量高, 可達培養(yǎng)液中10 g/L；
可以有真核生物的翻譯后修飾，如糖基化；
避免了釀酒酵母的過糖基化問題。
畢赤酵母具有高等真核表達系統(tǒng)的許多優(yōu)點：
1. 蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等。
2. 操作時與E.coli及釀酒酵母同樣簡單。它比桿狀病毒或哺乳動物組織培養(yǎng)等其它真核表達系統(tǒng)更快捷、簡單、廉價，且表達水平更高。
3. 同為酵母，畢赤酵母具有與釀酒酵母相似的分子及遺傳操作優(yōu)點，且它的外源蛋白表達水平是后者的十倍以至百倍。
這些使得畢赤酵母成為非常有用的蛋白表達系統(tǒng)。
畢赤酵母系統(tǒng)的注意事項
嚴格無菌操作，防止污染；可以鏡檢
溫度≤30C
轉(zhuǎn)化
PCR檢測
5. 誘導(dǎo)時間
蛋白質(zhì)糖基化
蛋白質(zhì)的糖基化是真核生物的一種常見的翻譯后修飾方式 ；
糖基化影響蛋白折疊、定位、轉(zhuǎn)運、生物活性、可溶性、抗原性、半衰期。
酵母蛋白糖基化
釀酒酵母與畢赤酵母大多數(shù)為N-連接糖基化高甘露糖型；
然而畢赤酵母中蛋白轉(zhuǎn)錄后所增加的寡糖鏈長度（平均每個支鏈8~14 個甘露糖殘基）比釀酒酵母中的（50~150 個甘露糖殘基）短得多；
釀酒酵母核心寡糖有末端α-1,3聚糖連接頭，而畢赤酵母則沒有。一般認為α-1,3聚糖接頭與蛋白的超抗原性有關(guān)，使得這些蛋白不適于治療應(yīng)用。
思考題
掌握宿主菌及其生產(chǎn)特征、表達載體等的定義與描述
分析比較基因工程大腸桿菌和酵母表達系統(tǒng)制藥的優(yōu)缺點，如何選擇應(yīng)用？
本文關(guān)鍵詞：基因工程，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
本文編號：241784
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