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中國(guó)HIV
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本站編輯：admin 日期： 2010-08-04 19:14 點(diǎn)擊：次
【中文摘要】:
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sH
【中文摘要】前言艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的免疫缺陷性疾病,目前尚無(wú)治愈手段,疫苗的研究也始終未有突破,根本原因在于對(duì)HIV生物學(xué)和人體免疫應(yīng)答機(jī)制及兩者之間的相互作用關(guān)系等科學(xué)問(wèn)題缺乏本質(zhì)上的理解和認(rèn)知,特別是對(duì)免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵調(diào)控作用的因子作用仍知之甚少。在免疫系統(tǒng)中,NKT細(xì)胞(natural killer T cell)表達(dá)恒定T細(xì)胞受體(TCR)αβ,可活化T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞,是天然免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁,為免疫系統(tǒng)中重要的調(diào)控細(xì)胞之一。因此,盡管其數(shù)量較少(人類約占外周血單個(gè)核細(xì)胞的0.01-1%),但在抗病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲、抗腫瘤及自身免疫病中均發(fā)揮了重要作用,其在HIV感染中的作用也日益引起重視。國(guó)外研究顯示,NKT細(xì)胞高表達(dá)CCR5,占T淋巴細(xì)胞百分率在急性HIV感染期顯著減少,且隨疾病進(jìn)展數(shù)量不斷下降。近期研究顯示,用NKT細(xì)胞特異性抗原α-半乳糖酰基鞘氨醇(α-GalCer)做HIV DNA疫苗佐劑可顯著提高HIV特異性T細(xì)胞及中和抗體反應(yīng)。上述研究結(jié)果提示,NKT細(xì)胞在HIV感染疾病進(jìn)程中可能發(fā)揮重要作用。中國(guó)人群和歐美人群遺傳背景不同,由其影響的細(xì)胞數(shù)量及表面分子表達(dá)水平可能存在差異,目前尚無(wú)HIV感染不同疾病進(jìn)展階段NKT細(xì)胞數(shù)量變化和中國(guó)HIV感染者NKT細(xì)胞及其亞型數(shù)量、CCR5表達(dá)水平的報(bào)道。本研究用Vα24+Vβ11+CD3+定義NKT細(xì)胞,研究中國(guó)HIV感染者不同疾病進(jìn)展階段NKT細(xì)胞及其亞型數(shù)量、CCR5表達(dá)水平及與HIV感染者疾病進(jìn)程的相關(guān)性,為HIV免疫致病研究提供新的思路。材料和方法1、研究對(duì)象53例未經(jīng)抗病毒治療的HIV/AIDS患者均來(lái)自中國(guó)河南,其中男性26例,女性26例,年齡分布為30-68歲(40.7±9.2),所有患者均經(jīng)Genelab公司蛋白印跡試劑盒確認(rèn)為HIV抗體陽(yáng)性。根據(jù)HIV感染時(shí)間和CD4+T細(xì)胞數(shù)量將上述患者分為HIV感染緩慢進(jìn)展組(SP組,感染時(shí)間＞10年,CD4+T細(xì)胞＞500個(gè)/μl)、典型進(jìn)展HIV組(HIV組,CD4+T細(xì)胞介于200-500個(gè)/μl之間,無(wú)艾滋病指征性疾病)和典型進(jìn)展AIDS組(AIDS組,CD4+T細(xì)胞＜200個(gè)/μl或出現(xiàn)艾滋病指征性疾病)。53例HIV/AIDS患者中SP組12例、HIV組28例、AIDS組13例。健康對(duì)照組為19例隨機(jī)抽取的HIV抗體陰性、未暴露于HIV的健康人,性別、年齡均與HIV/AIDS患者匹配,平均年齡為24-60歲(32.5±12.2),其中男性10名,女性9名。2、T細(xì)胞、NK細(xì)胞絕對(duì)值檢測(cè)T絕對(duì)值依據(jù)1997年美國(guó)CDC關(guān)于HIV感染者CD4+T細(xì)胞檢測(cè)指導(dǎo)方法,應(yīng)用BD公司TruCOUNT管、FACSCalibur流式細(xì)胞儀MULTISET軟件檢測(cè)。將20μl CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP試劑加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中,經(jīng)反向加樣法加入50μl抗凝血,室溫避光15min,加入免洗溶血素450μl,室溫避光15min,FACSMULTISET軟件檢測(cè)并進(jìn)行自動(dòng)分析,計(jì)算CD3+T/CD4+T/CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值。將20μl CD45FITC/CD16+56+PE/CD3PerCP試劑加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中,經(jīng)反向加樣法加入50μl抗凝血,室溫避光15min,加入免洗溶血素450μl,室溫避光15min,FACS MULTISET軟件檢測(cè)并進(jìn)行自動(dòng)分析,計(jì)算NK細(xì)胞絕對(duì)值。3、NKT細(xì)胞及其亞型絕對(duì)值、表面CCR5表達(dá)水平的檢測(cè)密度梯度離心法分離HIV感染者及健康人PBMC。向流式管中加入2x10~6PBMC及以下熒光標(biāo)記的單抗進(jìn)行染色:anti-Vα24-FITC、anti-Vβ11-PE、anti-CD3-PerCP、anti-CCR5-APC、anti-CD4-PE-Cy7,混勻后室溫避光30分鐘。用PBS洗滌后加入含1%多聚甲醛的PBS重懸,FACSAria流式細(xì)胞儀Diva軟件進(jìn)行分析。以FSC、SSC定義淋巴細(xì)胞、CD3-PerCP、Vα24-FITC、Vβ11-PE定義NKT細(xì)胞,計(jì)算NKT細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的百分比、CD4+/CD4-NKT細(xì)胞亞型占總NKT細(xì)胞的百分比及其CCR5的表達(dá)率。NKT細(xì)胞絕對(duì)值由其占CD3+T細(xì)胞的百分比乘以CD3+T細(xì)胞絕對(duì)值獲得。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SAS9.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同疾病進(jìn)展階段HIV感染者NKT細(xì)胞及其亞型數(shù)量、CCR5表達(dá)水平等用多個(gè)獨(dú)立樣本兩兩比較的Nemenyi法進(jìn)行比較,NKT細(xì)胞數(shù)量與疾病進(jìn)程相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn),P＜0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、HIV/AIDS患者NKT細(xì)胞及其亞型水平通過(guò)檢測(cè)外周血中NKT細(xì)胞數(shù)量發(fā)現(xiàn),HIV/AIDS患者NKT細(xì)胞數(shù)量顯著低于健康對(duì)照組(P＜0.05),AIDS組、HIV組、SP組、健康對(duì)照組NKT細(xì)胞均數(shù)依次上升,其中AIDS組顯著低于健康對(duì)照組(P＜0.05)。HIV/AIDS患者CD4+NKT細(xì)胞數(shù)量顯著低于健康對(duì)照組(P＜0.05),其中AIDS組顯著低于SP、HIV組和健康對(duì)照組(P＜0.05),SP、HIV組和健康對(duì)照組之間無(wú)顯著差異。HIV/AIDS患者CD4-NKT細(xì)胞數(shù)量顯著低于健康對(duì)照組(P＜0.05),其中AIDS組顯著低于健康對(duì)照組(P＜0.05)。不同疾病進(jìn)展階段HIV/AIDS患者NKT細(xì)胞占T淋巴細(xì)胞的百分率,CD4+/CD4-NKT細(xì)胞的比值,隨疾病進(jìn)展有降低趨勢(shì),但無(wú)顯著差異。2、NKT細(xì)胞及其各亞型CCR5的表達(dá)率HIV組及AIDS組患者CD4+CCR5+NKT細(xì)胞占NKT細(xì)胞百分率顯著低于健康對(duì)照(HIV組:1.23±2.34%;AIDS組:0.61±1.23%;健康對(duì)照:1.64±2.22%)。HIV/AIDS患者CCR5+NKT細(xì)胞中,CD4+NKT細(xì)胞的百分率(32±14%)顯著低于CD4-NKT細(xì)胞(62±25%)(P＜0.05)。HIV/AIDS患者NKT細(xì)胞CCR5表達(dá)率為9.57±12.97%,與健康對(duì)照(5.64±5.54%)無(wú)顯著差異,CD4+NKT細(xì)胞CCR5表達(dá)率為4.42±7.16%,與健康對(duì)照(3.59±4.41%)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。3、NKT細(xì)胞及其亞型與疾病進(jìn)展的相關(guān)性HIV/AIDS患者NKT細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞顯著正相關(guān)(r=0.33,P＜0.05),CD4+NKT細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞呈顯著正相關(guān)(r=0.51,P＜0.001),CD4-NKT細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞無(wú)顯著相關(guān),CD4+NKT細(xì)胞與CD4-NKT細(xì)胞呈顯著正相關(guān)。HIV/AIDS患者NKT細(xì)胞與CD4/CD8的比值顯著正相關(guān)(r=0.32,P＜0.05)。結(jié)論1、中國(guó)HIV/AIDS患者NKT細(xì)胞數(shù)量在疾病末期顯著下降,與疾病進(jìn)展相關(guān)。2、中國(guó)緩慢進(jìn)展者維持高水平NKT細(xì)胞數(shù)量可能為其疾病緩慢進(jìn)展的原因之一。
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