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本站編輯：admin 日期： 2010-08-17 21:15 點(diǎn)擊：次
【中文摘要】:
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【中文摘要】目的篩選乙型肝炎病毒啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子并對(duì)其中之一的apoA-Ⅰ因子與乙肝病毒各啟動(dòng)子的相互作用進(jìn)行深入研究。方法首先采用等離子共振技術(shù)對(duì)乙型肝炎病毒啟動(dòng)子結(jié)合蛋白進(jìn)行篩選:將結(jié)合有親和素的HBV各啟動(dòng)子耦聯(lián)在SA芯片上,使核酸序列游離于芯片之上,與流動(dòng)相的HepG2.2.15細(xì)胞核蛋白充分接觸,洗脫并回收與啟動(dòng)子結(jié)合的蛋白。該結(jié)合蛋白混合品經(jīng)short-gun質(zhì)譜分析,顯示在乙型肝炎病毒核心啟動(dòng)子、S1、S2啟動(dòng)子的結(jié)合蛋白中,均有載脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)。隨后構(gòu)建含有apoA-Ⅰ基因的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-apoA-Ⅰ及含有HBVS1、S2、X啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒pCAT3-S1、pCAT3-S2、pCAT3-X。用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,以pcDNA3.1及pCAT3-basic為對(duì)照。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后提取細(xì)胞蛋白,用檢測(cè)CAT的ELISA試劑盒檢測(cè)各組蛋白中報(bào)告基因CAT含量。然后再采用等離子共振技術(shù)對(duì)apoA-Ⅰ與各啟動(dòng)子的結(jié)合進(jìn)行驗(yàn)證及動(dòng)力學(xué)分析:將apoA-Ⅰ蛋白耦聯(lián)在CM5芯片上作為固定相,以各啟動(dòng)子核酸片段為流動(dòng)相,獲得該蛋白與各啟動(dòng)子核酸的結(jié)合動(dòng)力學(xué)參數(shù),并利用激光共聚焦顯微鏡和western blotting對(duì)該蛋白在HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位及表達(dá)水平進(jìn)行進(jìn)一步的研究。結(jié)果Real-time PCR結(jié)果顯示,乙肝病毒復(fù)制細(xì)胞模型HepG2.2.15細(xì)胞中apoA-ⅠmRNA表達(dá)顯著高于無(wú)乙肝病毒復(fù)制的細(xì)胞系HepG2。激光共聚焦結(jié)果顯示HepG2.2.15細(xì)胞核中可檢測(cè)到apoA-Ⅰ蛋白的表達(dá),而HepG2細(xì)胞核中則無(wú)。ApoA-Ⅰ可順式調(diào)控乙肝病毒核心啟動(dòng)子及X啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。ApoA-Ⅰ與乙肝病毒各啟動(dòng)子均有結(jié)合,其中與S2啟動(dòng)子的結(jié)合常數(shù)最高(7.98×10~5),與S1啟動(dòng)子的平衡解離常數(shù)最高7.66×10~(-4)。
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