本文關(guān)鍵詞：支氣管疾病論文，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。
GATA3
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本站編輯：admin 日期： 2010-08-13 22:11 點擊：次
【中文摘要】:
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人支氣管上皮細胞5
【中文摘要】支氣管哮喘是一種嚴重危害人類健康的常見病,多發(fā)病。目前認為,支氣管哮喘是以氣道可逆性阻塞、高反應(yīng)性和氣道炎癥為特征的一組綜合征,氣道炎癥是前兩者的基礎(chǔ)。在多種遺傳和環(huán)境因素共同作用下,經(jīng)過巨噬細胞(包括樹突狀細胞)的抗原呈遞作用,Na(?)ve T輔助細胞(Th 0)被活化,分化為Th 2細胞,釋放IL-4、IL-5、IL-13等多種Th 2細胞因子,促進了支氣管哮喘的形成和發(fā)展。其中IL-13是一種重要的Th2細胞因子,它通過誘導(dǎo)哮喘氣道炎癥、增加氣道高反應(yīng)性、促進粘液分泌,并參與了哮喘氣道重建,成為支氣管哮喘發(fā)病機制中的重要介質(zhì)。但迄今為止,對IL-13基因表達的分子調(diào)控機制仍知之甚少。T細胞是產(chǎn)生IL-13的主要來源。CD3/CD28雙信號通路對T細胞的刺激能夠模擬T細胞在體內(nèi)受抗原活化產(chǎn)生Th2細胞因子的過程。轉(zhuǎn)錄因子在基因的表達和調(diào)控上具有核心作用,GATA3是Th2細胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子,細胞中增高的GATA3能夠同時促進Th2細胞中IL-4、IL-5和IL-13的基因表達。許多研究表明在IL-13基因啟動子區(qū)域GATA位點對IL-13的基因表達起重要作用�；罨疶細胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)是TCR介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。我們的前期研究表明在CD3/CD28雙信號通路刺激后NFAT1與IL-13啟動子結(jié)合增強。在人IL-13基因啟動子區(qū)域GATA3與NFAT1位點鄰近,作為同時參與IL-13基因轉(zhuǎn)錄的GATA3和NFAT1間是否存在相互作用?如何相互作用?均值得進一步探討。本課題通過研究T細胞經(jīng)CD3/CD28活化后觀察GATA3和NFAT1在IL-13啟動子區(qū)域功能上的相互作用,探索IL-13基因轉(zhuǎn)錄的分子機制,并進一步研究糖皮質(zhì)激素丙酸氟替卡松(Fluticasonepropionate,FP)和傳統(tǒng)哮喘治療藥物三氧化二砷(Arsenic Troxide,AT)對該相互作用的影響。第一部分GATA3-NFAT1相互作用在人活化T細胞IL-13基因表達中的作用目的:研究T細胞在CD3/CD28雙信號通路共刺激活化后,細胞內(nèi)GATA3與NFAT1的結(jié)合情況及NFAT1抑制劑FK-506對GATA3與IL-13啟動子結(jié)合的影響,探討GATA3-NFAT1相互作用在T細胞IL-13基因表達中的作用。方法:采用CD3/CD28單克隆抗體(濃度分別為10μg/ml和5μg/ml)雙信號通路對Hut-78細胞進行共刺激,分別在0min、30min、1h、2h時采用免疫共沉淀(IP)的方法觀察GATA3與N-FAT1結(jié)合情況及FK-506對兩者結(jié)合的影響。通過染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)的方法研究NFAT1被FK-506阻斷后GATA3與IL-13啟動子區(qū)域的結(jié)合情況。結(jié)果:Hut-78細胞在CD3/CD28共刺激活化后,細胞內(nèi)NFAT1和GATA3結(jié)合增強,在刺激30min時兩者即有結(jié)合,隨著刺激時間的延長在1h、2h時兩者結(jié)合有進一步增強的趨勢,呈明顯的時間依賴性。FK-506(1n M)組在30min、1h、2h時均能抑制NFAT1與GATA3的結(jié)合,以2h時抑制更為明顯(2.25±0.1 VS 1.18±0.09),P＜0.05。用FK-506對NFATl進行抑制后,GATA3與IL-13的啟動子區(qū)域結(jié)合減弱。T細胞經(jīng)CD3/CD28免疫共刺激活化30分鐘時FK-506抑制GATA3與IL-13啟動子結(jié)合的作用不明顯,而在1h時能夠抑制GATA3同IL-13啟動子的結(jié)合(3.95±0.26 VS 2.82±0.44),2h時這種抑制效應(yīng)更為明顯,其抑制效應(yīng)約為50%(4.34±1.42 VS 1.73±0.09),P＜0.05。結(jié)論:T細胞經(jīng)過CD3/CD28共刺激活化后細胞內(nèi)NFAT1和GATA3結(jié)合增強,FK-506能抑制兩者的結(jié)合。FK-506能抑制GATA3與IL-13啟動子區(qū)域結(jié)合。FK-506可能通過影響兩者的結(jié)合,抑制了GATA3對IL-13基因轉(zhuǎn)錄的啟動。第二部分:FP抑制活化T細胞IL-13基因表達的機制目的:研究T細胞在CD3/CD28共刺激活化后,FP對NFAT1和GATA3結(jié)合的影響及FP對GATA3與IL-13啟動子結(jié)合的影響,探討FP抑制活化T細胞中IL-13基因表達的可能機制。方法:采用CD3/CD28單克隆抗體(濃度分別為10μg/ml和5gg/ml)雙信號通路對Hut-78細胞進行共刺激,分別在0min、30min、1h、2h時采用免疫共沉淀(IP)的方法觀察GATA3與NFAT1結(jié)合情況及FP對兩者結(jié)合的影響。通過染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)的方法研究FP對GATA3與IL-13啟動子結(jié)合的影響。結(jié)果:與對照組相比,經(jīng)CD3/CD28刺激組GATA3與NFAT1結(jié)合增強,且在30min、1h、2h各時間點逐漸增高,呈時間依賴性。FP(10~(-8)M)能夠部分抑制GATA3與NFAT1的結(jié)合,在細胞活化30min(1.33±0.08VS 0.91±0.083)、1h(1.97±0.18 VS 1.56±0.13)、2h(2.65±0.18 VS 1.80±0.23)時FP均可抑制兩者的結(jié)合(P＜0.05)。HUT-78細胞經(jīng)CD3/CD28雙信號通路共刺激活化后在30min、1h及2h各時間點GATA-3與IL-13啟動子區(qū)域結(jié)合逐漸增強。FP在細胞活化1h能顯著抑制GATA3與IL-13啟動子區(qū)域結(jié)合(8.19±2.1 8 VS 2.69±1.33),P＜0.05。結(jié)論:T細胞經(jīng)過CD3/CD28活化后GATA3與NFAT1結(jié)合增強,并促進GATA3與IL-13啟動子區(qū)域結(jié)合。FP可能部分通過影響GATA3和NFAT1的相互作用,抑制T細胞IL-13基因表達。第三部分:砷劑對活化T細胞IL-13基因表達的影響目的:研究T細胞在CD3/CD28雙信號通路刺激后IL-13的基因表達以及三氧化二砷對該基因表達的影響,并探討三氧化二砷(AT)抑制IL-13基因表達的可能機制。方法:采用CD3/CD28單克隆抗體(濃度分別為10μg/ml和5μg/ml)雙信號通路對Hut-78細胞進行共刺激,在30min及19h時用RT-PCR方法觀察IL-13mRNA表達及AT對IL-13mRNA表達的影響,并采用IP方法觀察在細胞活化0min、30min、1h、2h時GATA3與NFAT1結(jié)合情況及AT對兩者結(jié)合的影響。結(jié)果:CD3/CD28雙信號通路共刺激后,Hut-78細胞的IL-13mRNA表達增加,在19h時砷劑(5μM)能夠明顯抑制該基因的表達(6.77±2.78 VS 2.24±0.57),P＜0.05。Hut-78細胞在經(jīng)過CD3/CD28免疫活化30分鐘后,GATA3和NFATl兩者即有結(jié)合且在2小時內(nèi)兩者結(jié)合呈逐漸增強趨勢,AT在2h時能夠部分抑制兩者的結(jié)合(2.47±1.83VS 1.41±1.11,P＜0.05。結(jié)論:對Th2細胞IL-13基因轉(zhuǎn)錄表達的抑制可能是AT平喘抗炎的機制之一,該過程可能是通過部分抑制GATA3和NFAT1兩者相互作用實現(xiàn)的。
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