為提高鳳丹牡丹組培技術在生產(chǎn)實踐中的應用效率,以當年采收油用牡丹鳳丹成熟種胚為外植體進行離體培養(yǎng),設置不同光照及溫度培養(yǎng)條件、不同大小成熟種胚、不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比、不同質(zhì)量濃度外源添加物等處理,完善鳳丹牡丹胚培養(yǎng)體系;運用甲基化敏感多態(tài)性技術(MSAP)對培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的畸形組培苗進行甲基化水平及模式變異的分析。結果表明,試驗范圍內(nèi)最優(yōu)培養(yǎng)條件為接種后進行7 d暗培養(yǎng)隨即轉入光照培養(yǎng),適宜培養(yǎng)溫度為(25±1)℃;適宜外植體為≥3 mm的成熟種胚;最優(yōu)植物生長調(diào)節(jié)劑配比為0.8 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA,其基礎培養(yǎng)基為改良MS(Ca²⁺加倍)培養(yǎng)基;與不添加外源物質(zhì)相比,鳳丹牡丹胚乳的添加對成苗率具有極顯著抑制作用,添加75 mL/L椰汁處理組培養(yǎng)效果較好,成苗率為85.66%,添加1.0 g/L活性炭處理組成苗率最高,為90.46%。相較于正常組培苗,畸形苗總擴增位點數(shù)增多21.20%,總甲基化位點數(shù)減少12.97%;正常組培苗總甲基化率為85.38%,畸形苗總甲基化率為74.30%;畸形苗甲基化多態(tài)型變異占主導(82.37%),其中去甲...

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圖1鳳丹牡丹胚培養(yǎng)正常組培苗(A)和畸形組培苗(B)

以相同培養(yǎng)條件下初代培養(yǎng)正常組培苗與畸形組培苗(圖1)為材料,使用改良版CTAB法提取基因組DNA。純化后的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性。用NanoPhotometer(IMPLEN,德國)分光光度計檢測DNA樣品純度及濃度。其中畸形組培苗判斷標準為:畸形苗兩子葉間不長....

圖2鳳丹牡丹成熟種胚培養(yǎng)效果

圖2A為空白對照組,即基礎MS培養(yǎng)基中鳳丹牡丹成熟種胚培養(yǎng)效果,可以看出,子葉舒展真葉纖細弱小;圖2B為Z6處理,即添加0.8mg/LNAA+1.0mg/L6-BA處理組培養(yǎng)效果,可以看出,該組試管苗苗體稍壯,葉柄葉片較細;圖2C為D3處理,即添加75mL/L椰汁處理組....

圖3鳳丹牡丹畸形組培苗MASP擴增的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果

選用30對特異性引物進行篩選,最終確定使用26對引物進行畸形組培苗DNA甲基化水平分析,得到相關聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(圖3)。根據(jù)顯影結果可知,泳道內(nèi)共呈現(xiàn)4種條帶類型,分別為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型,分別代表4種DNA甲基化模式,依次為非甲基化、半甲基化、全甲基化和超甲基化。由....

本文編號：3935409