發(fā)布時(shí)間：2024-02-14 00:05

　　為明確蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒(apple scar skin viroid,ASSVd)在蘋(píng)果樹(shù)體內(nèi)的轉(zhuǎn)移規(guī)律,本研究建立高靈敏度的實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(real-time fluorescence quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)方法,利用此方法檢測(cè)該病毒在樹(shù)體內(nèi)的轉(zhuǎn)移規(guī)律以及蘋(píng)果果實(shí)上病毒積累量與癥狀的相關(guān)性。結(jié)果表明,本研究所建立的RT-qPCR檢測(cè)技術(shù)能針對(duì)枝皮、果實(shí)、根組織中的ASSVd進(jìn)行準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè),檢測(cè)靈敏度下限為41.00 fg/μL(相當(dāng)于5.95×105copies/μL RNA);在嘎拉蘋(píng)果樹(shù)上接種ASSVd,2個(gè)月后植株各組織部位病毒積累量均較高,尤其是接種枝先端和樹(shù)冠下層枝組,根部病毒積累量很少;接種4個(gè)月后,各組織部位病毒積累量下降,病毒在植株上部、下部和根部均勻分布;接種6個(gè)月后,在接種枝中下部和根部病毒積累量相對(duì)較高;接種8個(gè)月后,地上部各組織部位病毒積累量很低,主要集中在根部。在花臉癥果實(shí)著色不同的果皮中ASSVd積累量差異顯著,未著色果皮病毒積累量是著色果皮的4～40倍。表明ASSVd自...

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【部分圖文】：

圖1果樹(shù)嫁接接種ASSVd的位置及檢測(cè)部位示意圖

在2019年4月初采用芽接方式對(duì)多年不顯癥且經(jīng)RT-qPCR檢測(cè)不攜帶ASSVd的8年生嘎拉蘋(píng)果樹(shù)樹(shù)體中部接種ASSVd，在接種2、4、6和8個(gè)月分別在樹(shù)冠上層主枝枝組（圖1-A）、樹(shù)冠次上層主枝枝組（圖1-B）、病毒接種枝接種點(diǎn)近端（圖1-C）、病毒接種枝接種點(diǎn)遠(yuǎn)端（圖1-D....

圖2ASSVd的RT-qPCR檢測(cè)體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

對(duì)以線(xiàn)性化的質(zhì)粒為模板體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)缓蠓崔D(zhuǎn)錄，用引物ASSV‐dR2-F/R進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線(xiàn)中熒光增加值對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)與模板初始濃度基本呈線(xiàn)性關(guān)系，去除線(xiàn)性誤差較大的點(diǎn)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=-2.646x+65.170，相關(guān)系數(shù)R2=0.....

圖3ASSVdRT-qPCR檢測(cè)體系的特異性測(cè)定

為驗(yàn)證體系的特異性，對(duì)檢測(cè)攜帶ACLSV、ASGV、ASPV的蘋(píng)果組培苗及攜帶ASSVd、ApMV、ApNMV和ADFVd的蘋(píng)果枝皮進(jìn)行擴(kuò)增，由擴(kuò)增的熒光曲線(xiàn)可知只有攜帶ASSVd的樣品才有熒光信號(hào)（圖3），說(shuō)明該體系檢測(cè)ASSVd的特異性高；用健康組織RNA溶液對(duì)果皮、須根....

圖4三種不同蘋(píng)果組織部位的ASSVdRT-qPCR檢測(cè)靈敏度

定量測(cè)定ASSVd的增殖和轉(zhuǎn)移情況，結(jié)果顯示，接種2個(gè)月后，植株各組織部位病毒積累量均較高，尤其是接種枝先端和樹(shù)冠下層枝組，根部病毒積累量最少，為2.5×1013copies/g；接種4個(gè)月后，各組織部位病毒積累量與接種2個(gè)月后相比病毒積累量有所降低，除了植株冠層最頂端和接種枝先....

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