第一章    文獻綜述

在全球極端氣候事件不斷發(fā)生，世界人口數(shù)量正在不斷急劇增長，人類活動范圍擴大造成可耕作土壤面積降低，保證世界糧食安全的農業(yè)增長并未跟上糧食需求的增長背景下，糧食安全作為每個國家最重要的保障，成了一項非常重要的戰(zhàn)略任務。逆境脅迫（包含生物逆境和非生物逆境）是目前農業(yè)生產中影響糧食產量最重要的限制性因素。在作物的整個生長發(fā)育季節(jié)中，會受到很多來自不同方面的不利環(huán)境因素的影響，使得植物生長緩慢，受到制約或者停止生長，最終導致作物品質下降，產量降低甚至絕產。其中，干旱、鹽、營養(yǎng)元素不均衡（包括礦物質中毒和礦物質缺乏）和極端溫度（高溫，低溫等）是影響全世界作物量的主要限制因素，每年直接由鹽堿、干旱、低溫等非生物逆境脅迫造成農作物的減產超過總產的20%。干旱和鹽脅迫是這些嚴重影響作物生產的環(huán)境逆境因子中最主要的因素，是亟需研究和解決的科學和實際問題。在世界范圍內，高于45%的農業(yè)耕地正遭受連年或者常年干旱威脅，而全世界38%的人口依賴這些土地生存，我國每年有7億畝農田受旱災威脅，干旱所造成的損失幾乎是其它自然災害所造成損失的總和。同時，我國有大量蘇打鹽堿地，鹽漬化土壤漫延迅速，超過一半耕地受鹽漬化侵蝕變成低產田，同時90%以上種植區(qū)的作物因水源和降雨不足進一步加劇了鹽害程度，從而嚴重影響了作物的豐產和穩(wěn)產，在當前人口多，耕地少的大環(huán)境下，，鹽堿地改造以及通過基因工程改造作物耐鹽性具有深遠的意義。

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第二章  四翅濱藜抗鹽相關基因的篩選

2.1  材料

因為酵母質粒的拷貝數(shù)較低，直接用于 DNA 測序不能得到好的結果，故需要進行酵母質粒 DNA 營救。將（1）中提取出來的 DNA 電擊轉化（Gene Pulser Xcell Electroporation System, BioRad，USA ）到大腸桿菌 DH5α 中，然后用 PCR 進行驗證加入片段（引物為 T7 和 pYES-R）。將 PCR 擴增出條帶的大腸桿菌單克隆接種到 5 ml LB （100 mg/l 氨芐抗性）后 37 ，220 rpm過夜搖培，質粒提取用天根公司 TIANprep Mini Plasmid Kit （TIANGEN，China）完成。將提取的質粒 DNA 在深圳華大公司完成 DNA 測序，測序引物為 T7 和pYES-R （引物序列見附錄二）。 

2.2  方法

將購買四翅濱藜種子用紗布保濕放在 28 培養(yǎng)箱中黑暗保存三到四天直至種子萌發(fā)，后將萌發(fā)的四翅濱藜種子移植到花土中，放到 21 到 23  恒溫培養(yǎng)箱中，100 μmol photons.m-2.s-1，相對濕度為 60 %，14 h 光照/10 h黑暗處理，兩個月后將四翅濱藜植物移植到相同光照和溫度的 1/2 Hoagland 溶液中進行水培[86]。移植到上述水培條件下一周后，在 1/2 Hoagland 溶液中補充 400 mM NaCl 處理 48 h。植物嫩枝和根部在處理 48 h后收集起來，用液氮瞬間冰凍起來，保存在-80   備用。

第三章  四翅濱藜 AcNIP5;1基因抗逆功能解析 ...................... 44 

3.1  實驗材料 ............. 44
3.2  實驗方法 ............. 47
3.3  實驗結果 ............................. 52
3.4  結論與討論 ........................... 64 
第四章  四翅濱藜水通道蛋白 AcPIP2 抗逆功能解析 ................. 67 
4.1  實驗材料 .......... 67 
4.2  實驗方法 .......................... 67
4.3  結果 ....................... 70
4.4  結論與討論 ..................... 85 
第五章  四翅濱藜重金屬脅迫相關蛋白 AcHMA1 抗逆功能解析 ..................... 88 
5.1  實驗材料與方法 ................. 88
5.2  實驗結果 ................ 91
5.3  討論與結論 ........... 99

第五章  四翅濱藜重金屬脅迫相關蛋白 AcHMA1 抗逆功能解析 

5.1  實驗材料與方法

很多重金屬離子是生命代謝活動中的重要成分，但是當重金屬含量超過一定值時往往出對生物體具有毒害作用。而金屬耐受蛋白對這種毒害作用具有一定抗性。本研究從鹽生植物四翅濱藜中分離和鑒定了一個重金屬相關蛋白（heavy metal associated protein） AcHMA1。序列分析表明AcHMA1含有兩個重金屬結合結構域。對四翅濱藜進行重金屬脅迫（Fe，Cu，Ni，Cd 或Pb），干旱（PEG6000） 和 堿（NaHCO3） 等脅迫處理能夠高度誘導AcHMA1在四翅濱藜中表達但鹽（NaCl）和低溫脅迫使AcHMA1的表達量下降。隨后，本研究利用酵母表達系統(tǒng)檢測轉AcHMA1酵母在重金屬脅迫下的耐受性。在酵母中過表達AcHMA1 能夠顯著增加酵母細胞對過量鐵脅迫耐受性， AcHMA1 同時也提高了酵母細胞對鹽，堿，干旱和活性氧脅迫的耐受力。最后，亞細胞定位結果表明AcHMA1-eGFP融合表達蛋白定位在煙草細胞中的細胞膜上。因此，該研究結果表明AcHMA1 編碼一個定位在細胞膜上的對重金屬離子有一定抗性的重金屬相關蛋白。同時，AcHMA1也可能參加植物對其他非生物脅迫的抗性。這部分內容整理發(fā)表在International Journal of Molecular Sciences上。 

5.2  實驗結果

從四翅濱藜cDNA文庫中通過EST測序獲得一個全長為1270 bp的cDNA序列，命名為AcHMA1 （GenBank登錄號：KF863910）。該cDNA編碼一個包含316個氨基酸的開放閱讀框，其中該編碼蛋白富含賴氨酸（為總氨基酸含量的13.6%），該蛋白計算分子量為35.5 kDa，預計等電點pI為8.6。將AcHMA1放到NCBI BLASTP網站中進行序列分析搜索其來自不同植物的相似蛋白，結果表明AcHMA1和一個來源于葡萄（V. vinifera）的一個并未鑒定功能的蛋白同源性最高（圖5.1）。
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結  論

綜合而言，本論文主要從構建鹽脅迫下四翅濱藜cDNA文庫進行EST測序和利用酵母篩選兩種方法分離和篩選這種鹽生植物中抗逆基因。通過酵母表達篩選得到53個抗鹽蛋白，并對相關基因的抗鹽特性利用qRT-PCR和酵母表達進行初步驗證,此為第二章主要研究內容,相關數(shù)據(jù)已經整理完成投稿.在前期cDNA構建中篩選得到三個通道蛋白家族成員,其中AcNIP5;1和AcPIP2為水通道蛋白亞家族，而AcHMA1為離子通道蛋白家族成員。通常通道蛋白家族成員在植物抗逆過程中扮演重要角色，為了研究AcNIP5;1，AcPIP2和AcHMA1在植物抗逆方面具體功能，分別對AcNIP5;1，AcPIP2和AcHMA1進行了系統(tǒng)而詳細的功能研究，通過酵母表達和在模式植物擬南芥中驗證功能，干旱和重金屬脅迫方面的初步功能。論文主要完成內容是對AcNIP5;1，AcPIP2和AcHMA1基因的鑒定和初步功能分析，但是對于相關調控網絡和作用機理還需要深入研究，以完善人們對于植物中不同通道蛋白不同作用機理和生物學功能的認識，同時增強人們對鹽生植物四翅濱藜抗鹽機制決定基因及調控網絡的了解與認識。

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參考文獻（略）

本文編號：125065