目的:對桂郁金SSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行建立與優(yōu)化,使其適合分析桂郁金遺傳多樣性等研究內(nèi)容。方法:通過正交設(shè)計(jì)法對PCR反應(yīng)體系的引物,模板,2×Taq PCR MasterMix(包括Tap DNA聚合酶,dNTPs,緩沖液等)以及擴(kuò)增程序進(jìn)行建立和優(yōu)化。結(jié)果:桂郁金SSR-PCR反應(yīng)的最佳體系是在15μL的反應(yīng)體系中,DNA模板2.5μL (25 ng·μL^-1),引物1.0μL(1.0μmol·L^-1),2×Taq PCR MasterMix6μL,其中Tap DNA聚合酶0.05 U·μL^-1,Mg²⁺3.0 mmol·L^-1,dNTPs0.3 mmol·L^-1,加ddH₂O至15μL。PCR反應(yīng)程序的最佳參數(shù)設(shè)定為變性30 s,退火30 s,延伸45 s,循環(huán)35次。結(jié)論:建立了桂郁金SSR-PCR反應(yīng)體系,并通過10份桂郁金材料進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示該體系穩(wěn)定可靠,可以為桂郁金引物開發(fā),良種選育繁育等相關(guān)研究提供參考。

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【部分圖文】：

圖1桂郁金SSR-PCR反應(yīng)體系L9(33)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)擴(kuò)增效果

對實(shí)驗(yàn)建立的9個不同組合進(jìn)行分析與優(yōu)化,由于模板,引物以及MIX含量的不同,結(jié)果差異明顯。如圖1所示。9個組合均能擴(kuò)增出條帶,5,7,8,9反應(yīng)體系擴(kuò)增得到的條帶弱,特異性差,2,3,4,6反應(yīng)體系擴(kuò)增得到的條帶較清晰,其中反應(yīng)體系4條帶多,特異性最好。即在15μL體系中,DNA....

圖2桂郁金SSR-PCR反應(yīng)程序L16(44)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)擴(kuò)增效果

對實(shí)驗(yàn)所建立的16組SSR-PCR反應(yīng)程序的不同組合進(jìn)行分析與優(yōu)化,結(jié)果如圖2所示。組合條件的不同導(dǎo)致了擴(kuò)增條帶的差異。表現(xiàn)為條帶的顏色深淺不同,效果存在著較大區(qū)別。組合2,13,14條帶較淺,穩(wěn)定性也較差,反應(yīng)體系不理想,綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果,反應(yīng)程序10條帶清晰,穩(wěn)定性較好,因此將反....

圖3桂郁金不同退火溫度擴(kuò)增效果

退火溫度的確定是利用以上確定的最佳反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進(jìn)行的,本梯度試驗(yàn)的范圍是54.0～56.5℃。結(jié)果如圖3所示。當(dāng)溫度低于54.5℃時(shí),主帶不清晰,且有許多較淺的雜帶,當(dāng)溫度超過55.5℃時(shí),條帶的穩(wěn)定性以及多態(tài)性下降。在退火溫度為55℃時(shí),條帶的清晰度,穩(wěn)定性等均較好,由此....

圖410份桂郁金材料擴(kuò)增效果

采用10份不同種質(zhì)的桂郁金材料對優(yōu)化得到的體系進(jìn)行驗(yàn)證。擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示,10份桂郁金材料均可以擴(kuò)增出清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的條帶,由此也證明了該優(yōu)化體系的合理性和適用性。4討論

本文編號：3937018