為了明確GsSnRK1.1蛋白激酶在野生大豆生長發(fā)育中的具體調(diào)控機制,該研究利用酵母二元雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)了蛋白激酶GsSnRK1.1的互作蛋白GsPP2CA和GsPKA,利用原核表達系統(tǒng)對GsSnRK1.1、GsPP2CA和GsPKA進行了表達和純化用于Pull-down和體外磷酸化分析,并在酵母中研究了GsPP2CA和GsPKA對GsSnRK1.1蛋白活性的調(diào)控功能。結(jié)果表明:(1)GsSnRK1.1與GsPP2CA和GsPKA具有物理互作關(guān)系,Phos-Tag和pPKDsub特異性磷酸化抗體檢測發(fā)現(xiàn),GsSnRK1.1的Thr176磷酸化可以被蛋白磷酸酶GsPP2CA去磷酸化,GsPKA可能會磷酸化GsSnRK1.1的其他潛在磷酸化位點,進而競爭性抑制GsSnRK1.1的Thr176位點的磷酸化水平。(2)將這些基因回補進入酵母ARY330(-snf1/-reg1/-sit4)突變株系中,發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)化GsSnRK1.1和GsPP2CA或GsPKA的轉(zhuǎn)化子可在非葡萄糖碳源和高葡萄糖碳源的選擇培養(yǎng)基上正常生長,GsPP2CA、GsPKA可以替代Reg1和Sit4降低GsSnRK1.1過度磷酸...

【文章頁數(shù)】：10 頁

【文章目錄】：
1 材料和方法
    1.1 試驗材料
    1.2 方 法
        1.2.1 cDNA合成及PCR擴增
        1.2.2 PCR產(chǎn)物的克隆、鑒定與載體構(gòu)建
        1.2.3 序列比對和保守結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)分析
        1.2.4 酵母雙雜交試驗
        1.2.5 融合蛋白的原核表達與蛋白純化
        1.2.6 GST-pull down實驗
        1.2.7 蛋白質(zhì)磷酸化實驗
        1.2.8 酵母缺失突變體的回補
2 結(jié)果與分析
    2.1 GsPP2CA、GsSnRK1.1及GsPKA基因全長的獲得
    2.2 GsSnRK1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析
    2.3 GsPP2CA、GsPKA與GsSnRK1.1互作分析
    2.4 GsPP2CA、GsPKA對GsSnRK1.1磷酸化水平的調(diào)控
    2.5 GsPP2CA、GsPKA分別與GsSnRK1.1基因共同轉(zhuǎn)化回補缺失基因的ARY330酵母
3 討 論



本文編號：3841543