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實驗27植物體內(nèi)GS谷氨酰胺合成酶活力的測定；【原理】；谷氨酰胺合成酶（GS）是植物體內(nèi)氨同化的關鍵酶之；【儀器與用具】；冷凍離心機；分光光度計；天平；研缽；恒溫水�。患�；提取緩沖液：；2+；0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，；反應混合液A（0.1mol/LTris-HCl緩；2+；內(nèi)含80mmol/LMg，20mmol/L谷氨酸；反應混合液B

實驗27 植物體內(nèi)GS谷氨酰胺合成酶活力的測定

【原理】

谷氨酰胺合成酶（GS）是植物體內(nèi)氨同化的關鍵酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物體內(nèi)谷氨酸形成谷氨酰胺。在反應體系中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為γ─谷氨�；惲u肟酸，進而在酸性條件下與鐵形成紅色的絡合物，該絡合物在540nm處有最大吸收峰，可用分光光度計測定。谷氨酰胺合成酶活性可用產(chǎn)生的γ─谷氨�；惲u肟酸與鐵絡合物的生成量來表示，單位μmol·mg﹣1protein·h﹣1。也可間接用540nm處吸光值的大小來表示，單位A·mg﹣1﹣1 protein·h。

【儀器與用具】

冷凍離心機；分光光度計；天平；研缽；恒溫水��；剪刀；移液管（2ml、1ml）。 【試劑】

提取緩沖液：

2+

0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，內(nèi)含2mmol/LMg，2mmol/L DTT，0.4mol/L蔗糖。稱取Tris（三羥甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO4·7H2O，0.1543g DTT（二硫蘇糖醇）和34.25g蔗糖，去離子水溶解后，用0.05 mol/L HCl調(diào)至pH8.0，最后定容至250ml；

反應混合液A（0.1mol/L Tris-HCl緩沖，pH7.4）：

2+

內(nèi)含80mmol/L Mg，20mmol/L谷氨酸鈉鹽，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，稱取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO4·7H2O, 0.8628g谷氨酸鈉鹽，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去離子水溶解后，用0.1mol/L HCl調(diào)至pH7.4，定容至250ml；

反應混合液B（含鹽酸羥胺，pH7.4）：

反應混合液A的成分再加入80mol/L鹽酸羥胺，pH7.4；

顯色劑（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）： 3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl3·6H2O，去離子水溶解后，加5ml濃鹽酸，定容至100ml； 40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去離子水中（臨用前配制）。 【方法】

1.粗酶液提取 稱取植物材料1g于研缽中，加3ml提取緩沖液，置冰浴上研磨勻漿，轉(zhuǎn)移于離心管中，4℃下15,000g離心20min，上清液即為粗酶液。 2.反應 1.6ml反應混合液B，加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，混勻，于37℃下保溫半小時，加入顯色劑1ml，搖勻并放置片刻后，于5,000g下離心10min，取上清液測定540nm處的吸光值，以加入1.6ml反應混合液A的為對照。

3.粗酶液中可溶性蛋白質(zhì)測定 取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取2ml 用考馬斯亮藍G-250測定可溶性蛋白質(zhì)（見實驗28）。 4.原始數(shù)據(jù)記載 5.結果計算：

A

GS活力(A·mg﹣1 protein·h﹣1)＝P?V?t 式中 A—540nm處的吸光值；

P—粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）； V—反應體系中加入的粗酶液體積（ml）； T—反應時間（h）。

可溶性蛋白質(zhì)含量的測定 ——考馬斯亮藍法 一、原理

考馬斯亮藍G-250測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結合法的一種�？捡R斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質(zhì)結合后變?yōu)榍嗌鞍踪|(zhì)-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應十分迅速；其結合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1000μg／mL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。 二、材料、主要儀器和試劑 1、實驗材料：植物葉片。 2、主要儀器

（1）分析天平、臺式天平；（2）刻度吸管；（3）具塞試管、試管架；（4）研缽；（5）離心機、離心管；（6）燒杯、量筒；（7）微量取樣器；（8）分光光度計。 3、試劑

（1）牛血清白蛋白標準溶液的配制：準確稱取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸餾水中，即為1000μg／mL的原液。

（2）考馬斯亮藍G-250蛋白試劑的配制：稱取100mg考馬斯亮藍G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1000mL。此溶液在常溫下可放置1個月。 （3）乙醇；

（4）磷酸（85％）。 四、操作步驟

1、標準曲線制作

（1）0~100μg／mL標準曲線的制作：取6支10mL干凈的具塞試管，按表1取樣。蓋塞后，將各試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合，放置2min后用1cm光經(jīng)的比色杯在595nm波長下比色，記錄各管測定的光密度OD595nm，并做標準曲線。

（2）0~1000μg／mL標準曲線的制作：另取6支10mL具塞試管，按表2取樣。其余步驟同（1）操作，做出蛋白質(zhì)濃度為0~1000μg／mL的標準曲線。

2、樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定

（1）待測樣品制備：稱取樣品2g放入研缽中，加2mL蒸餾水研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中，再用6mL蒸餾水分次洗滌研缽，洗滌液收集于同一離心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4000r/min離心20min，棄去沉淀，，上清液轉(zhuǎn)入10mL容量瓶，并以蒸餾水定容至刻度，即得待測樣品提取液。

（2）測定：另取2支10mL具塞試管，按下表取樣。吸取提取液0.1mL（做一重復），放入具塞刻度試管中，加入5mL考馬斯亮藍G-250蛋白試劑，充分混合，放置2min后用1cm光徑比色杯在595nm下比色，記錄光密度OD595nm，并通過標準曲線查得待測樣品提取液中蛋白質(zhì)的含量X（μg）。以標準曲線1號試管做空白。

五、結果計算

樣品蛋白質(zhì)含量（mg∕g鮮重）=(C×V/a)/W

式中：C為查標準曲線所得每管蛋白質(zhì)含量（mg）； V為提取液總體積（ml）；

A為測定所取提取液體積（ml）； W為取樣量（g）。

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