本文關(guān)鍵詞：海南省衛(wèi)生廳科研基金，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

用等位基因特異聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè) 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因突變

來源：青年人(Qnr.Cn) 更新時(shí)間：2010/3/16 19:28:27  【字體： 】

　葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏癥是中國南方人群中一種常見的遺傳病之一，與藥物性溶血、感染性溶血及新生兒高膽紅素血癥等有密切的關(guān)系。引起G6PD缺乏癥的主要原因是G6PD基因點(diǎn)突變［1］�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)引起中國人G6PD缺乏癥的突變主要是1376G→T、1388G→A、95A→G、392G→T、592C→T及1024C→T等六種突變［2-5］。以往檢測(cè)這些已知的突變，主要用錯(cuò)配擴(kuò)增酶切法、等位基因寡核苷酸探針雜交等方法［2-5］。最近，杜傳書等［6］報(bào)道用突變特異性擴(kuò)增系統(tǒng)(amplification refractory mutation system,ARMS)來檢測(cè)中國人G6PD基因3種常見的突變。在此，我們介紹類似的檢測(cè)已知G6PD基因突變的方法。

對(duì)象和方法

1　研究對(duì)象　經(jīng)核苷酸順序測(cè)定確定為1376G→T的男性樣品3份，經(jīng)錯(cuò)配擴(kuò)增酶切法確定為95A→G的男性樣品3份和392G→T的男性樣品2份。正常對(duì)照樣品10份。
2　引物順序及擴(kuò)增區(qū)域　擴(kuò)增95A→G的引物：上游引物GdL1：5′-GGCGACGACGACGAAGCGCAG-3′;下游引物GdR2：5′-TTCCTGGCTTTTAAGATTGGG-3′;特異引物95G：5′-CTTCCATCAGTCGGATAGACG-3′。擴(kuò)增392G→T的引物：上游引物GdL5: 5′-AAGAGAGGGGCTGACATCTG-3′;下游引物GdR5: 5′-CACGCTCATAGAGTGGTGGG-3′;特異引物392T：5′-AGAGGCGGTTGGCCTGTCACA-3′。 擴(kuò)增1376G→T的引物：上游引物GdL11：5′-TGGTGGCAGGCAGTGGCATCAGCAA-3′;下游引物GdR13：5′-ATGGTCCCGGAGTCCTCCCGACTCG-3′;特異引物1376T：5′-GGGTGAAAATACGCCAGGCCACAA-3′。為了增加等位基因特異性引物的特異性，我們?cè)?種特異引物的3′端的第4個(gè)堿基處增加一個(gè)錯(cuò)配堿基。擴(kuò)增區(qū)域見圖1。在檢測(cè)每種突變的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)中，均含有相應(yīng)的上、下游引物及等位基因特異性引物。
3　PCR擴(kuò)增的條件及結(jié)果觀察　反應(yīng)體積為25μl，含基因組DNA 0.5μg，2.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，30～50ng引物，1U Taq DNA聚合酶(PE公司或MBI公司)。擴(kuò)增95G→A和392G→T的條件為：1×PCR緩沖液(PE公司)，PCR循環(huán)：94℃ 50s，60℃ 50s，72℃ 80s，共31個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增1376G→T的條件為：1×PCR緩沖液(MBI公司)，PCR循環(huán)：94℃ 50s，66℃ 50s，72℃ 80s，共31個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物加在20g/L瓊脂糖凝膠上電泳，用溴乙錠染色，在紫外燈下觀察結(jié)果。

結(jié)果和討論

　　突變特異性擴(kuò)增系統(tǒng)(ARMS)也稱為等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)(allele specific PCR)，是一種檢測(cè)已知突變的方法［7］。其原理是根據(jù)PCR擴(kuò)增時(shí)引物的延伸主要取決于引物3′端第1和第2位堿基是否與模板配對(duì)，3′端與模板不配對(duì)的引物不能延伸，根據(jù)已知的突變可以設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物。引物設(shè)計(jì)是此法檢測(cè)突變的關(guān)鍵。有研究表明，不同的錯(cuò)配對(duì)阻止引物延伸的效果不同，如果在引物3′端的第2～4個(gè)堿基處增加一個(gè)錯(cuò)配堿基，則可增加引物延伸的特異性［7,8］；在檢測(cè)G6PD基因的某些突變時(shí)，A/G錯(cuò)配更能有效地阻止引物延伸［6］。我們?cè)谠O(shè)計(jì)引物時(shí)，392T和1376T兩種引物采用A/G錯(cuò)配，95G引物采用G/T錯(cuò)配，并在此三種引物3′端的第4個(gè)堿基處增加了一個(gè)錯(cuò)配堿基。用等位基因特異PCR檢測(cè)已知突變時(shí)，還應(yīng)注意PCR的質(zhì)控，如果PCR不出現(xiàn)擴(kuò)增區(qū)帶，原因除了是不存在所檢測(cè)的突變外，還可能是DNA的質(zhì)量問題。因此，用等位基因特異PCR檢測(cè)突變時(shí)，最好選擇一個(gè)PCR擴(kuò)增片段作為內(nèi)對(duì)照，以便判斷PCR的質(zhì)量。有些學(xué)者選擇與突變位點(diǎn)無關(guān)、擴(kuò)增效果穩(wěn)定的片段作為內(nèi)對(duì)照［6,9］。在我們的檢測(cè)中，我們選擇突變位點(diǎn)所在的外顯子及外顯子兩側(cè)的區(qū)域的擴(kuò)增片段作為內(nèi)對(duì)照，使擴(kuò)增的內(nèi)對(duì)照片段既作為PCR的質(zhì)控，又可作為擴(kuò)增突變位點(diǎn)的模板。在PCR產(chǎn)物中，正常樣品只出現(xiàn)一條對(duì)照帶，而有突變的樣品，除了出現(xiàn)對(duì)照帶外，還出現(xiàn)特異的擴(kuò)增區(qū)帶。我們?cè)么朔z測(cè)人β珠蛋白41-42缺失突變，有較好的效果［10］。圖2為檢測(cè)三種突變的PCR結(jié)果。在檢測(cè)95G→A突變的PCR產(chǎn)物中，正常樣品只出現(xiàn)一條812bp的擴(kuò)增區(qū)帶，有95G→A突變的樣品出現(xiàn)812bp和94bp兩條擴(kuò)增區(qū)帶；在檢測(cè)392G→T突變的PCR產(chǎn)物中，正常樣品只出現(xiàn)一條343bp的擴(kuò)增區(qū)帶，有392G→T突變的樣品出現(xiàn)343bp和195bp兩條擴(kuò)增區(qū)帶；在檢測(cè)1376G→T突變的PCR產(chǎn)物中，正常樣品只出現(xiàn)一條590bp的擴(kuò)增區(qū)帶，有1376G→T的樣品出現(xiàn)590bp和261bp兩條擴(kuò)增區(qū)帶。我們分析了10份正常樣品及含有95G→A、392G→T及1376G→T突變的樣品，未發(fā)現(xiàn)有假陽性和假陰性，表明我們?cè)O(shè)計(jì)的三種等位基因特異性引物具有高度特異性，能特異地檢測(cè)上述三種突變。

圖1　3個(gè)突變位點(diǎn)的擴(kuò)增區(qū)域示意圖

1～4號(hào)樣品為392G→T的擴(kuò)增結(jié)果:1,2為突變樣品,3,4為正常對(duì)照;5～9號(hào)樣品為95A→G的擴(kuò)增結(jié)果:5,6為正常對(duì)照,7～9為突變樣品;10為分子量標(biāo)準(zhǔn):100bp ladder;11～15號(hào)樣品為1376G→T的擴(kuò)增結(jié)果:11,12為正常對(duì)照,13～15為突變樣品;16為分子量標(biāo)準(zhǔn):1kb ladder
圖2　3個(gè)突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增結(jié)果

　　到目前為止，在中國人中至少已發(fā)現(xiàn)15種G6PD基因突變［1,11］，其中最常見的是1376G→T、1388G→A、95A→G、392G→T、592C→T及1024C→T等六種突變［2-5］，占G6PD基因突變的71%～95%，但仍有部分G6PD缺乏癥的突變類型尚未被發(fā)現(xiàn)。以往檢測(cè)這些已知突變主要用錯(cuò)配擴(kuò)增酶切法、等位基因寡核苷酸探針雜交等方法。雖然這些方法能有效地篩查G6PD基因突變，但是費(fèi)用較高、操作煩瑣或需同位素。因此，建立更加簡便、快速、經(jīng)濟(jì)的篩查方法仍有必要。等位基因特異PCR是一種較好的檢測(cè)已知突變的方法，已應(yīng)用于多種遺傳病(如β-地中海貧血)的基因突變的檢測(cè)［9,12］。最近，杜傳書等［6］報(bào)道了檢測(cè)中國人中三種常見G6PD基因突變(1388G→A，1376G→T，95A→G)的等位基因特異PCR方法，對(duì)于G6PD缺乏癥的篩查，加快尋找新突變的速度具有重要的意義。與錯(cuò)配擴(kuò)增酶切法、等位基因寡核苷酸探針雜交等方法比較，等位基因特異PCR更加簡便、快速、經(jīng)濟(jì)。目前，已建立了檢測(cè)中國人中4種常見的G6PD基因突變(1388G→A，1376G→T，392G→T，95A→G)的等位基因特異PCR方法，進(jìn)一步完善其它常見G6PD基因突變的等位基因特異PCR的篩查方法，對(duì)于G6PD基因突變的篩查將具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

基金項(xiàng)目:海南省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目（94－18）
作者單位：蔡望偉（570102　�？�，海南醫(yī)學(xué)院生化教研室）
周代鋒（570102　�？�，海南醫(yī)學(xué)院生化教研室）
鄺宇（570102　�？冢Ｄ厢t(yī)學(xué)院生化教研室）
蔡蘭潔（570102　�？�，海南醫(yī)學(xué)院生化教研室）
周玉英（570102　�？�，海南醫(yī)學(xué)院生化教研室）

參 考 文 獻(xiàn)

1，Vulliamy T,Luzzatto L,Hirono A,et al.Hematologically important mutations：glucose-6-phosphate dehydrogenase.Blood Cells Mol Dis,1997,23：302-313.
2，Chang JG，Chiou SS，Perng LI,et al.Molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase（G6PD）deficiency by natural and amplification created restriction sites：five mutations account for most G6PD deficiency cases in Taiwan.Blood,1992,80：1079-1082.
3，杜傳書，王菁，陳路明，等.中國人中所見的六種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因的點(diǎn)突變.中華血液學(xué)雜志，1993，14：395-398.
4，唐東生，馬燮琴，宋誠燕，等.干血紙片法用于廣東人G6PD基因點(diǎn)突變篩查研究.中華血液學(xué)雜志，1998，，19：189-191.
5，謝建生，龍桂芳，唐志寧，等.廣西地區(qū)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因突變研究.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，1998，15：151-154.
6，Du CS,Ren XQ,Chen L,et al.Detection of the most common G6PD gene mutations in Chinese using amplification refractory mutation system.Hum Hered，1999，49：133-138.
7，Newton CR,Graham A,Heptinstall LE,et al.Analysis of any point mutation in DNA.The amplification refractory mutation system(ARMS).Nucl Acid Res,1989,17：2503-2516.
8，Kwok S,Kello DE,McKinney N,et al.The effect of primer-templete mismatch on the polymerase chain reaction: human immunodeficiency virus type 1 model studies.Nucl Acid Res,1990,181：999-1005.
9，杜傳書，曾瑞萍，任曉琴，等.用ARMS法檢測(cè)β地中海貧血C654-2T突變.中華血液學(xué)雜志，1998，19：544-545.
10，周代鋒,韓建勛，蔡望偉，等.用等位基因特異PCR篩查海南漢族人β-珠蛋白基因41-42(-CTTT)缺失突變.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，1998，15：186.
11，Ren XQ,He YS,Du CS,et al.A novel missense mutation(G1381A) in the G6PD gene identified in a Chinese man.Hum Mut,1998,12：219.
12，毛躍華，孫瓊，李爭，等.應(yīng)用多重等位基因特異PCR技術(shù)進(jìn)行β-地中海貧血基因診斷.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，1995，12：209-211.

(收稿日期:1999-07-05)

    責(zé)任編輯：想飛 

【字體： 】【】【】【】【】【】

  本文關(guān)鍵詞：海南省衛(wèi)生廳科研基金，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。