【目的】本研究旨在克隆并鑒定松墨天牛Monochamus alternatus內(nèi)源漆酶基因MaLac1,分析其在松墨天牛不同發(fā)育階段的表達(dá)水平,為進(jìn)一步明確MaLac1功能提供依據(jù)�！痉椒ā炕谒赡炫Ｄc道轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),通過RACE克隆松墨天牛MaLac1基因的全長cDNA序列,并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析;將該基因與pET-32a載體鏈接構(gòu)建表達(dá)載體pET-MaLac1,導(dǎo)入大腸桿菌Escherichia coli Rosetta （DE3）使其表達(dá);使用qPCR檢測(cè)MaLac1基因在松墨天牛不同發(fā)育階段（低齡幼蟲、老熟幼蟲、蛹、雌成蟲和雄成蟲）腸道中的表達(dá)差異�！窘Y(jié)果】克隆獲得松墨天牛MaLac1的cDNA全長序列（GenBank登錄號(hào):KY073340）。MaLac1開放閱讀框全長2 067 bp,編碼一個(gè)含688個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),預(yù)測(cè)分子量為78.34 kD,等電點(diǎn)為5.30。SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)MaLac1在N端包含一個(gè)15個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。序列比對(duì)分析表明,MaLac1具有典型的昆蟲漆酶基因特征,與赤擬谷盜Tribolium castaneum漆酶基因的氨... 

【文章來源】：昆蟲學(xué)報(bào). 2020,63(04)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

鄰接法構(gòu)建的基于松墨天牛漆酶MaLac1和其他昆蟲Lac氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))

qPCR結(jié)果顯示,MaLac1基因在松墨天牛腸道中廣泛表達(dá),轉(zhuǎn)錄水平在不同發(fā)育階段存在顯著差異(F=6.82, P<0.05)。松墨天牛低齡幼蟲和老熟幼蟲腸道中MaLac1的表達(dá)水平相近,均顯著低于成蟲的(P<0.05);在松墨天牛的蛹期腸道中,MaLac1的表達(dá)量增加,但仍顯著低于成蟲期的(P<0.05);在松墨天牛的成蟲期,MaLac1在雌成蟲腸道中的表達(dá)量略高于雄成蟲的,均顯著高于幼蟲期和蛹期的(P<0.05)(圖4)。圖4 MaLac1在不同發(fā)育階段松墨天牛腸道中的表達(dá)分析

根據(jù)課題組前期獲得的松墨天牛轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)(Wu et al., 2016),篩選出松墨天牛漆酶保守序列信息,設(shè)計(jì)并合成引物。提取松墨天牛新鮮腸道組織總RNA(圖1: A),逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板,PCR擴(kuò)增后得到該基因中間片段。根據(jù)獲得的松墨天牛漆酶基因保守序列分別設(shè)計(jì)目的基因的5′和3′RACE特異引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增克隆測(cè)序。根據(jù)中間片段序列、5′RACE和3′RACE結(jié)果進(jìn)行序列拼接,獲得一條總長為2 395 bp的cDNA序列,其中編碼區(qū)長度為2 067 bp(圖1: B),5′端非編碼區(qū)118 bp(圖1: C),3′端非編碼區(qū)210 bp(圖1: D),命名此基因?yàn)镸aLac1(GenBank登錄號(hào): KY073340)。MaLac1基因編碼一個(gè)含688個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),編碼蛋白分子量為78.34 kD,等電點(diǎn)為5.30。 信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明,N端第1-15位氨基酸為信號(hào)肽區(qū)。MaLac1基因編碼多肽的原子組成為C3500H5306N940O1042S35,不穩(wěn)定系數(shù)是31.66,穩(wěn)定性強(qiáng)。MaLac1基因的編碼蛋白有80.15的脂肪系數(shù),總平均親水性為-0.314,通過軟件ProtParam分析表明,MaLac1基因的編碼蛋白親水區(qū)域較多,為親水性蛋白。利用在線TMpred軟件對(duì) MaLac1基因編碼蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)分析,結(jié)果表明MaLac1基因編碼蛋白具有2個(gè)跨膜域和1個(gè)疑似跨膜域。每個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域有17～18個(gè)氨基酸殘基。使用SOPMA等軟件和Swiss-model軟件分析MaLac1基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),結(jié)果表明MaLac1編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占比57.99%,α-螺旋占比9.3%,β-折疊占比5.23%,α-螺旋與無規(guī)則卷曲間的伸展鏈占比27.47%,表明三級(jí)結(jié)構(gòu)中構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要骨架為無規(guī)則卷曲。2.2 松墨天牛MaLac1蛋白與其他已知昆蟲漆酶基因序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]松墨天牛成蟲行為與化學(xué)生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J]. 史先慧,馬濤,陸雪雷,沈婧,孫朝輝,溫秀軍,鄧培雄.  林業(yè)科學(xué)研究. 2017(05)
[2]單寧酸對(duì)紅、綠色型豌豆蚜生長發(fā)育及繁殖的影響[J]. 邵婭,王森山,葉超.  草地學(xué)報(bào). 2017(04)
[3]松墨天�；瘜W(xué)感受組織熒光定量PCR內(nèi)參基因的鑒定與篩選[J]. 馮波,郭前爽,毛必鵬,杜永均.  昆蟲學(xué)報(bào). 2016(04)
[4]昆蟲漆酶的研究進(jìn)展[J]. 于孟蘭,倪金鳳.  生物加工過程. 2014(01)
[5]中國松材線蟲病研究[J]. 張鍇,梁軍,嚴(yán)冬輝,張星耀.  世界林業(yè)研究. 2010(03)
[6]中國松材線蟲病空間分布格局[J]. 潘宏陽,葉建仁,吳小芹.  生態(tài)學(xué)報(bào). 2009(08)
[7]木材白腐菌分解木質(zhì)素的酶系統(tǒng)-錳過氧化物酶、漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶催化分解木質(zhì)素的機(jī)制[J]. 池玉杰,伊洪偉.  菌物學(xué)報(bào). 2007(01)
[8]松墨天牛生物學(xué)特性的研究[J]. 王玲萍.  福建林業(yè)科技. 2004(03)
[9]松材線蟲及其關(guān)鍵傳媒墨天牛的研究進(jìn)展[J]. 寧眺,方宇凌,湯堅(jiān),孫江華.  昆蟲知識(shí). 2004(02)

博士論文
[1]肚倍蚜適應(yīng)單寧環(huán)境機(jī)理的初步研究[D]. 李芒.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011



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