本研究利用組成型啟動子ptet,汞誘導型啟動子pmerR,表面展示冰晶核蛋白INP,鎘的金屬硫蛋白Mt3α,汞的金屬結合蛋白MerR,以及作為熒光標記的加強型綠色熒光蛋白EGFP等,經(jīng)基因工程技術構建融合基因ptet-inp-mt3a-egfp, ptet-inp-merR-egfp,及pmerR-inp-merR-egfp。 宿主細菌為惡臭假單胞菌X4,腐生型革蘭氏陰性細菌,對環(huán)境的抗逆性很強,能夠耐受并吸附汞和鎘等重金屬。將構建的融合基因插入到X4基因組,獲得了3株工程菌株： X4-1:X4/(ptet-INP-Mt3α-EGFP)(組成型表達,吸附鎘) X4-2:X4/(ptet-INP-MerR-EGFP)(組成型表達,吸附汞) X4-3:X4/(pmerR-INP-MerR-EGFP)(誘導性表達,汞檢測和吸附) 通過在熒光顯微鏡下觀察菌體驗證了融合基因的正常表達,Western Blotting技術驗證了融合蛋白展示到細胞膜表面。 隨著細菌X4-1、X4-2的生長,融合蛋白的表達量也相應的增加,說明組成型啟動子ptet穩(wěn)定性好。X4-3在2μM汞離子條件下誘導2h就能達到較...

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【學位級別】：碩士

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目錄
摘要
Abstract
縮略詞(Abbreviation)
1 前言
    1.1 重金屬污染現(xiàn)狀
        1.1.1 重金屬對生物體的毒性
        1.1.2 中國重金屬污染現(xiàn)狀
    1.2 土壤環(huán)境中重金屬污染的治理方法
        1.2.1 土壤重金屬污染的修復方法
        1.2.2 重金屬污染的檢測
    1.3 細胞表面展示技術在重金屬污染治理中的應用
        1.3.1 金屬硫蛋白的研究進展
        1.3.2 細胞表面展示金屬硫蛋白吸附重金屬
    1.4 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗菌株和質粒
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 主要試劑
            2.1.3.1 培養(yǎng)基
            2.1.3.2 制備大腸桿菌感受態(tài)所需試劑
            2.1.3.3 SDS-PAGE試劑
            2.1.3.4 質粒抽提試劑
            2.1.3.5 抗生素試劑
            2.1.3.6 試劑盒和酶
    2.2 實驗方法
        2.2.1 重組質粒的構建
            2.2.1.1 質粒pVLT33-IMeE的構建
            2.2.1.2 質粒pUC19-ptet-egfg的構建
            2.2.1.3 質粒pUC19-pmerR-egfg的構建
            2.2.1.4 質粒pTn-ptet-IMeE的構建
            2.2.1.5 質粒pTn-ptet-IMtE的構建
            2.2.1.6 質粒pTn-pmerR-IMeE的構建
        2.2.2 基因克隆操作方法
            2.2.2.1 大腸桿菌TG1感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣法)
            2.2.2.2 質粒的抽提
            2.2.2.3 PCR聚合酶鏈式反應
            2.2.2.4 雙酶切體系
            2.2.2.5 T₄酶連體系
            2.2.2.6 PCR及酶切產(chǎn)物的純化
            2.2.2.7 瓊脂糖凝膠電泳分離DNA
            2.2.2.8 啟動子ptet和pmerR特異性和靈敏性檢測
            2.2.2.9 兩親本雜交獲得工程菌
        2.2.3 工程菌株性能的測定
            2.2.3.1 菌液熒光值的測定
            2.2.3.2 工程菌株在熒光顯微鏡下的發(fā)光圖
            2.2.3.3 大腸桿菌細胞分級分離
            2.2.3.4 Western Blotting實驗步驟
            2.2.3.5 工程菌生長曲線,熒光曲線的測定
            2.2.3.6 工程菌X4-3在汞離子條件下誘導時間的確定
            2.2.3.7 工程菌X4-3在汞離子誘導條件下的相對熒光值
            2.2.3.8 工程菌汞離子和鎘離子的耐受性
            2.2.3.9 工程菌對鎘和汞的吸附
            2.2.3.10 工程菌在土壤中的定殖存活能力
            2.2.3.11 工程菌在土壤中對鎘和汞的修復能力
3 結果與分析
    3.1 啟動子ptet和pmerR特異性和靈敏性的檢測
    3.2 PCR驗證工程菌的插入融合基因
    3.3 工程菌株在熒光顯微鏡下的發(fā)光圖
    3.4 細胞分級分離以及Western Blotting結果
    3.5 工程菌生長曲線和熒光曲線的測定
    3.6 工程菌X4-3在汞離子條件下最佳誘導時間的確定
    3.7 工程菌X4-3在不同濃度汞離子誘導下的相對熒光值
    3.8 工程菌對汞離子和鎘離子的耐受性
    3.9 工程菌對鎘和汞的吸附能力
    3.10 工程菌在土壤中的定殖能力
4 討論
參考文獻
致謝



本文編號：3959311