本研究利用組成型啟動(dòng)子ptet,汞誘導(dǎo)型啟動(dòng)子pmerR,表面展示冰晶核蛋白INP,鎘的金屬硫蛋白Mt3α,汞的金屬結(jié)合蛋白MerR,以及作為熒光標(biāo)記的加強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP等,經(jīng)基因工程技術(shù)構(gòu)建融合基因ptet-inp-mt3a-egfp, ptet-inp-merR-egfp,及pmerR-inp-merR-egfp。 宿主細(xì)菌為惡臭假單胞菌X4,腐生型革蘭氏陰性細(xì)菌,對(duì)環(huán)境的抗逆性很強(qiáng),能夠耐受并吸附汞和鎘等重金屬。將構(gòu)建的融合基因插入到X4基因組,獲得了3株工程菌株： X4-1:X4/(ptet-INP-Mt3α-EGFP)(組成型表達(dá),吸附鎘) X4-2:X4/(ptet-INP-MerR-EGFP)(組成型表達(dá),吸附汞) X4-3:X4/(pmerR-INP-MerR-EGFP)(誘導(dǎo)性表達(dá),汞檢測(cè)和吸附) 通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察菌體驗(yàn)證了融合基因的正常表達(dá),Western Blotting技術(shù)驗(yàn)證了融合蛋白展示到細(xì)胞膜表面。 隨著細(xì)菌X4-1、X4-2的生長(zhǎng),融合蛋白的表達(dá)量也相應(yīng)的增加,說(shuō)明組成型啟動(dòng)子ptet穩(wěn)定性好。X4-3在2μM汞離子條件下誘導(dǎo)2h就能達(dá)到較...

【文章頁(yè)數(shù)】：54 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
目錄
摘要
Abstract
縮略詞(Abbreviation)
1 前言
    1.1 重金屬污染現(xiàn)狀
        1.1.1 重金屬對(duì)生物體的毒性
        1.1.2 中國(guó)重金屬污染現(xiàn)狀
    1.2 土壤環(huán)境中重金屬污染的治理方法
        1.2.1 土壤重金屬污染的修復(fù)方法
        1.2.2 重金屬污染的檢測(cè)
    1.3 細(xì)胞表面展示技術(shù)在重金屬污染治理中的應(yīng)用
        1.3.1 金屬硫蛋白的研究進(jìn)展
        1.3.2 細(xì)胞表面展示金屬硫蛋白吸附重金屬
    1.4 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 主要試劑
            2.1.3.1 培養(yǎng)基
            2.1.3.2 制備大腸桿菌感受態(tài)所需試劑
            2.1.3.3 SDS-PAGE試劑
            2.1.3.4 質(zhì)粒抽提試劑
            2.1.3.5 抗生素試劑
            2.1.3.6 試劑盒和酶
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.2.1.1 質(zhì)粒pVLT33-IMeE的構(gòu)建
            2.2.1.2 質(zhì)粒pUC19-ptet-egfg的構(gòu)建
            2.2.1.3 質(zhì)粒pUC19-pmerR-egfg的構(gòu)建
            2.2.1.4 質(zhì)粒pTn-ptet-IMeE的構(gòu)建
            2.2.1.5 質(zhì)粒pTn-ptet-IMtE的構(gòu)建
            2.2.1.6 質(zhì)粒pTn-pmerR-IMeE的構(gòu)建
        2.2.2 基因克隆操作方法
            2.2.2.1 大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞的制備(氯化鈣法)
            2.2.2.2 質(zhì)粒的抽提
            2.2.2.3 PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
            2.2.2.4 雙酶切體系
            2.2.2.5 T₄酶連體系
            2.2.2.6 PCR及酶切產(chǎn)物的純化
            2.2.2.7 瓊脂糖凝膠電泳分離DNA
            2.2.2.8 啟動(dòng)子ptet和pmerR特異性和靈敏性檢測(cè)
            2.2.2.9 兩親本雜交獲得工程菌
        2.2.3 工程菌株性能的測(cè)定
            2.2.3.1 菌液熒光值的測(cè)定
            2.2.3.2 工程菌株在熒光顯微鏡下的發(fā)光圖
            2.2.3.3 大腸桿菌細(xì)胞分級(jí)分離
            2.2.3.4 Western Blotting實(shí)驗(yàn)步驟
            2.2.3.5 工程菌生長(zhǎng)曲線,熒光曲線的測(cè)定
            2.2.3.6 工程菌X4-3在汞離子條件下誘導(dǎo)時(shí)間的確定
            2.2.3.7 工程菌X4-3在汞離子誘導(dǎo)條件下的相對(duì)熒光值
            2.2.3.8 工程菌汞離子和鎘離子的耐受性
            2.2.3.9 工程菌對(duì)鎘和汞的吸附
            2.2.3.10 工程菌在土壤中的定殖存活能力
            2.2.3.11 工程菌在土壤中對(duì)鎘和汞的修復(fù)能力
3 結(jié)果與分析
    3.1 啟動(dòng)子ptet和pmerR特異性和靈敏性的檢測(cè)
    3.2 PCR驗(yàn)證工程菌的插入融合基因
    3.3 工程菌株在熒光顯微鏡下的發(fā)光圖
    3.4 細(xì)胞分級(jí)分離以及Western Blotting結(jié)果
    3.5 工程菌生長(zhǎng)曲線和熒光曲線的測(cè)定
    3.6 工程菌X4-3在汞離子條件下最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定
    3.7 工程菌X4-3在不同濃度汞離子誘導(dǎo)下的相對(duì)熒光值
    3.8 工程菌對(duì)汞離子和鎘離子的耐受性
    3.9 工程菌對(duì)鎘和汞的吸附能力
    3.10 工程菌在土壤中的定殖能力
4 討論
參考文獻(xiàn)
致謝



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