有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphates, OPs)具有殺蟲效率高、防治范圍廣、成本低等特點(diǎn)，在保護(hù)農(nóng)作物免受病蟲害侵染、提高糧食產(chǎn)量等方面發(fā)揮了巨大作用。但它們對(duì)人類的生存環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，并導(dǎo)致瓜果與蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)，直接危害人類與動(dòng)物的健康。所以有機(jī)磷農(nóng)藥降解方面的研究在環(huán)境保護(hù)和食品安全方面受到了高度關(guān)注。 研究發(fā)現(xiàn)，一些能降解有機(jī)磷農(nóng)藥的降解菌的降解作用是通過產(chǎn)生有機(jī)磷降解酶來實(shí)現(xiàn)的。而直接使用此類有機(jī)磷降解酶降解有機(jī)磷農(nóng)藥的效率遠(yuǎn)高于使用產(chǎn)生此類酶的降解菌。 來源于土壤桿菌屬Agrobacterium radiobacter P230的有機(jī)磷降解酶(OpdA)具有底物范圍廣和催化效率高的特點(diǎn)，因此被公認(rèn)為是迄今為止最具有應(yīng)用前景的有機(jī)磷降解酶。有機(jī)磷降解酶通過水解有機(jī)磷農(nóng)藥的磷脂鍵，最終實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥的無毒化。本研究旨在利用已有的研究基礎(chǔ)，建立有機(jī)磷降解酶基因(opdA)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)其高效表達(dá)；同時(shí)對(duì)枯草芽孢桿菌的電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，建立高效的電轉(zhuǎn)化方法，并構(gòu)建有機(jī)磷降解酶基因(opdA)在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)系統(tǒng)，克服重組蛋白在大腸桿菌表達(dá)系...

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 引言
    1.2 降解有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物及其降解酶的研究進(jìn)展
        1.2.1 降解有機(jī)磷農(nóng)藥的微生物
        1.2.2 有機(jī)磷降解酶
        1.2.3 有機(jī)磷降解酶編碼基因
    1.3 有機(jī)磷降解酶（OpdA）的簡介
    1.4 有機(jī)磷降解酶 OpdA 的作用機(jī)理
        1.4.1 OpdA 活性位點(diǎn)與金屬配位
        1.4.2 OpdA 的作用機(jī)制
    1.5 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展
    1.6 食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)
    1.7 枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展
    1.8 立文依據(jù)與研究內(nèi)容
第二章 有機(jī)磷降解酶基因(opdA)在大腸桿菌中的高效表達(dá)與酶學(xué)研究
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑
        2.2.1 菌株與質(zhì)粒
        2.2.2 試劑
        2.2.3 培養(yǎng)基及有關(guān)溶液的配制
        2.2.4 主要儀器
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 有機(jī)磷降解酶基因（opdA）大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.2 有機(jī)磷降解酶基因（opdA）在大腸桿菌 BL21 中誘導(dǎo)表達(dá)及條件的優(yōu)化
        2.3.3 OpdA 重組蛋白的純化與復(fù)性
        2.3.4 復(fù)性后蛋白含量的測(cè)定
        2.3.5 有機(jī)磷降解酶(OpdA) 酶活力的測(cè)定與動(dòng)力學(xué)分析
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 opdA 基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.4.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化
        2.4.3 純化后蛋白含量的測(cè)定
        2.4.4 復(fù)性后重組蛋白的活力測(cè)定與動(dòng)力學(xué)分析
    2.5 討論
第三章 枯草芽孢桿菌的電轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化研究
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑
        3.2.1 菌株與質(zhì)粒
        3.2.2 試劑
        3.2.3 培養(yǎng)基及有關(guān)溶液的配制
        3.2.4 主要儀器
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 培養(yǎng)基的配置
        3.3.2 宿主菌 DH5α中抽提質(zhì)粒 pHY300PLK
        3.3.3 GM 培養(yǎng)基的優(yōu)化
        3.3.4 EM 培養(yǎng)基的優(yōu)化
        3.3.5 RM 培養(yǎng)基的優(yōu)化
        3.3.6 電擊電壓的優(yōu)化
        3.3.7 質(zhì)粒濃度的優(yōu)化
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 質(zhì)粒 pHY300PLK 的提取
        3.4.2 GM 培養(yǎng)基對(duì)電轉(zhuǎn)化率的影響
        3.4.3 EM 培養(yǎng)基對(duì)電轉(zhuǎn)化率的影響
        3.4.4 RM 培養(yǎng)基對(duì)電轉(zhuǎn)化率的影響
        3.4.5 電擊電壓對(duì)電轉(zhuǎn)化率的影響
        3.4.6 質(zhì)粒濃度對(duì)電轉(zhuǎn)化率的影響
    3.5 討論
第四章 有機(jī)磷降解酶基因在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)與酶學(xué)性質(zhì)
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑
        4.2.1 菌株與質(zhì)粒
        4.2.2 試劑
        4.2.3 培養(yǎng)基及有關(guān)溶液的配制
        4.2.4 主要儀器
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 有機(jī)磷水解酶基因（opdA）枯草芽孢桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.3.2 有機(jī)磷降解酶基因（opdA）在枯草芽孢桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及其條件優(yōu)化
    4.4 結(jié)果和分析
        4.4.1 opdA 基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.4.2 重組菌株 WB800N/pHT43-opdA 的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化
        4.4.3 重組蛋白含量的測(cè)定
        4.4.4 有機(jī)磷降解酶（OpdA）酶活力的測(cè)定與動(dòng)力學(xué)分析
        4.4.5 誘導(dǎo)條件對(duì)有機(jī)磷降解酶（OpdA）酶活力的影響
        4.4.6 有機(jī)磷降解酶（OpdA）的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析
    4.5 討論
全文小結(jié)
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間的論文及研究成果
致謝



本文編號(hào)：3788086