1  引言 

1.1  畢氏腸微孢子蟲
微孢子蟲（Microsporidia）是一類細(xì)胞內(nèi)專性寄生的真核生物，是感染人和動物比較常見的病原體[1]。在已知并被命名的 160 個(gè)屬的 1300 多個(gè)蟲種中，共有 8 個(gè)屬中的 14 個(gè)蟲種可以感染人類[2]。畢氏腸微孢子蟲（Enterocytozoon  bieneusi）是引起人腹瀉的一種機(jī)會性病原體，據(jù)報(bào)道大約 90%的畢氏腸微孢子蟲病例都與免疫抑制相關(guān)[3]，然而畢氏腸微孢子蟲也不斷在免疫功能正常者、家畜、伴侶動物、野生動物及鳥中被發(fā)現(xiàn)。當(dāng)宿主與被感染的人和動物、污染的食物和水源接觸時(shí)就會感染畢氏腸微孢子蟲病[1,4-6]。該病原對于免疫功能正常的群體主要能夠引起自限性腹瀉，而對于免疫功能不全的宿主（HIV 陽性患者）或者是免疫力低下的宿主（如幼齡或老齡人和動物）會引起脫水性腹瀉，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[1,4-6]。 微孢子蟲的生活史包括 4 個(gè)階段：呈卵塊發(fā)育的原形體階段、呈孢子生殖的原形體階段、孢子母細(xì)胞階段和孢子階段，這四個(gè)階段都與宿主細(xì)胞質(zhì)直接接觸，孢子侵入細(xì)胞時(shí)伸出極管穿入宿主細(xì)胞，將孢子質(zhì)通過中空的極管注入宿主細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。孢子質(zhì)在靠近宿主細(xì)胞核的空泡內(nèi)通過裂體增殖和孢子增殖，發(fā)育為孢子。孢子從破裂的宿主細(xì)胞中釋放并隨糞便排出體外，被其他宿主攝入。 最初，人們主要通過電子顯微鏡觀察微孢子蟲的孢子或其內(nèi)生發(fā)育階段的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定[7]。隨著分子生物學(xué)工具的介入，將分子生物學(xué)分型技術(shù)與流行病學(xué)研究進(jìn)行結(jié)合，用于鑒定人和動物中微孢子蟲的蟲種和基因型，從而了解微孢子蟲的傳播方式。 畢氏腸微孢子蟲包括多個(gè)基因型并具有廣泛的宿主范圍。由于不同分離株在核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS )的序列差異較大，因此基于該位點(diǎn)的序列分析已廣泛應(yīng)用于人和動物畢氏腸微孢子蟲基因分型研究中。通過比較不同宿主畢氏腸微孢子蟲的 ITS 基因序列，發(fā)現(xiàn)不同的畢氏腸微孢子蟲基因型之間，其生物學(xué)特性也有差異。例如，有些畢氏腸微孢子蟲基因型只能感染人和特定的動物宿主，它們被認(rèn)為具有宿主特異性[3,8]；而部分基因型則能同時(shí)感染人和動物，具有人獸共患可能性。
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1.2  賈第蟲
賈第蟲（Giardia）是人中最常見的腸道寄生蟲，據(jù)報(bào)道在亞洲，非洲和拉丁美洲大約有2 億人感染賈第蟲并表現(xiàn)出一定的臨床癥狀。人一旦感染了賈第蟲病，就會引起腹瀉、腹痛、腹脹、體重減輕、吸收不良等主要癥狀。除了感染人外，賈第蟲也可感染家養(yǎng)動物（包括牛、羊、犬、貓）和野生動物，并能引起幼齡和老齡動物產(chǎn)生劇烈腹瀉等癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。因此，賈第蟲�。╣iardiasis）被認(rèn)為是重要的人獸共患寄生蟲病。賈第蟲生活史簡單。感染性包囊是該寄生蟲的感染性階段，隨糞便排出體外并含有有絲分裂滋養(yǎng)體，在寒冷、潮濕的環(huán)境下仍可生存數(shù)月并具感染性。當(dāng)宿主攝入含有感染性包囊的糞便時(shí)，在十二指腸內(nèi)脫囊釋放出滋養(yǎng)體。滋養(yǎng)體經(jīng)過多次有絲分裂形成能夠抵御膽汁酸和其它環(huán)境刺激的耐性包囊，并通過小腸隨糞便排出體外，通過污染水源和食物或與宿主直接接觸而傳播賈第蟲病。 
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2  材料與方法 

2.1  材料 
本研究于 2013 年 9 月至 2014 年 7 月，對黑龍江省哈爾濱市、大慶市和齊齊哈爾市三個(gè)地區(qū)的郊區(qū)農(nóng)戶飼養(yǎng)的不同年齡段的羊群進(jìn)行了調(diào)查，共采集糞便樣本 489 份，其中哈爾濱164 份、大慶 154 份（<1  year）和齊齊哈爾 171 份（<1  year；n  =148；>1  year；n=  23）。每份樣本大約收集 30g。將哈爾濱收集到的糞便樣本保存到 50ml 的一次性塑料樣本盒中，并標(biāo)注好樣本年齡和性別等信息。運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后將糞便樣本浸入到 2.5%的重鉻酸鉀溶液中混勻，4°C 保存?zhèn)溆�。大慶和齊齊哈爾的樣本收集在一次性無菌乳膠手套中，運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室后直接保存于-20°C 冰箱中用于 DNA 提取。
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2.2  方法
對于保存在重鉻酸鉀中的哈爾濱糞便樣本在提取 DNA 之前用滅菌水洗滌兩次（12  000 r/min,  5min），以除去糞便中的重鉻酸鉀，，而保存在-20°C 冰箱中的大慶和齊齊哈爾糞便樣本可直接用于 DNA 的提取。DNA 的提取過程在糞便提取試劑盒的操作說明的基礎(chǔ)上加以改良，增加了玻璃珠打碎和液氮反復(fù)凍融兩個(gè)步驟。具體步驟如下： (1)  取 100-300 mg 糞便樣本，置于 2 ml 離心管中。 (2)  加入 1 ml Buffer SW，渦旋振蕩 1 min，12,000 rpm 離心 1 min，棄上清。 (3)  加入 800 μl Buffer SL 和 0.2 g 玻璃珠，渦旋震蕩 10 min，加入 600 μl Buffer GL。 (4)  液氮中冷凍  5 min，99 °C 孵育  5 min，重復(fù) 5 次，最后一次 99 °C 孵育  10 min。 (5)  12,000 rpm 離心 5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至吸附柱中（可分多次轉(zhuǎn)入），12,000 rpm 離心 1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 (6)  向吸附柱中加入 500 μl Buffer GW1（使用前檢查是否已加入無水乙醇），12,000 rpm 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 (7)  重復(fù)步驟 7。 (8)  向吸附柱中加入 500 μl Buffer GW2（使用前檢查是否已加入無水乙醇），10,000 rpm 離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 (9)  12,000 rpm 離心 2 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入新的 1.5 ml 離心管中，室溫放置 2 min。 (10) 向吸附柱中懸空滴加 50 μl Buffer GE，室溫放置 5 min，10,000 rpm 離心 1 min，收集 DNA溶液，-20°C 保存 DNA。  
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3  結(jié)果與分析 ........ 19 
3.1  綿羊畢氏腸微孢子蟲的分子鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析 ............ 19 
3.1.1  畢氏腸微孢子蟲的感染率 ......... 19 
3.1.2  畢氏腸微孢子蟲基因型的分布 .......... 20 
3.1.3  畢氏腸微孢子蟲系統(tǒng)進(jìn)化分析 .......... 22 
3.2  畢氏腸微孢子蟲多位點(diǎn)序列分型研究 .... 24 
3.2.1  微衛(wèi)星和小衛(wèi)星位點(diǎn)巢式 PCR 擴(kuò)增結(jié)果 ............ 24 
3.2.2  微衛(wèi)星和小衛(wèi)星位點(diǎn)序列分型 .......... 25 
3.2.3  微衛(wèi)星和小衛(wèi)星位點(diǎn)系統(tǒng)進(jìn)化分析 ............ 26 
3.3  綿羊賈第蟲的分子鑒定及分型 ....... 27 
3.3.1  賈第蟲的感染率 ...... 27 
3.3.2  賈第蟲基因型的分布 ........ 28 
3.4  綿羊隱孢子蟲蟲種/基因型的鑒定 ........... 29 
4  討論........... 30 
4.1  畢氏腸微孢子蟲的感染情況、基因型分布及多位點(diǎn)序列分型 ........... 30 
4.2  賈第蟲的感染情況和基因型分布 ............ 31
4.3  隱孢子蟲的感染情況和蟲種分布 ............ 32 
5  結(jié)論........... 33

4  討論 

4.1  畢氏腸微孢子蟲的感染情況、基因型分布及多位點(diǎn)序列分型

黑龍江省是我國農(nóng)業(yè)大省之一，養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)。哈爾濱、大慶和齊齊哈爾均位于黑龍江省西南部，在這些地區(qū)，家畜一般以家庭散養(yǎng)式居多，因此動物糞便中含有的畢氏腸微孢子蟲對公共衛(wèi)生威脅很大。目前有很多畢氏腸微孢子蟲流行病學(xué)研究是關(guān)于哺乳動物和鳥類，但針對綿羊的有關(guān)研究還很少見[3,17]。刁瑞南[17]首次在綏化（東北地區(qū)）兩只斷奶前羔羊中發(fā)現(xiàn)了組 2 中的基因型 BEB6（2/40，5%）。隨后，Stensvold[14]等在瑞典的 72 只羔羊中檢測49（68.1%）個(gè)畢氏腸微孢子蟲陽性樣本，經(jīng)鑒定為組 2 中的基因型 BEB6、OEB1 和 OEB2；相反，在 37 只成年羊中并未發(fā)現(xiàn)畢氏腸微孢子蟲陽性。 最近，Zhang[68]等對中國河南、遼寧和黑龍江三個(gè)省綿羊畢氏腸微孢子蟲的感染情況進(jìn)行了調(diào)查研究，感染率分別為 51.9%（161/310）、9.4%（6/64）和 25.0%（10/40），該研究發(fā)現(xiàn)各個(gè)年齡組的綿羊都可感染畢氏腸微孢子蟲，在小于 3 月齡的 25 只羔羊中檢測到 13 個(gè)陽性（52.0%），在 3 到 6 月齡的 86 只小羊中發(fā)現(xiàn) 45 個(gè)陽性（52.3%），在 6 月齡到 1 歲之間的52 只小羊中發(fā)現(xiàn) 20 個(gè)陽性（38.5%），在大于 1 歲的 251 只成年羊中發(fā)現(xiàn) 99 個(gè)陽性（39.4%）。本研究中綿羊感染畢氏腸微孢子蟲的檢測結(jié)果：在哈爾濱年齡分組不詳?shù)?164 只綿羊中發(fā)現(xiàn)11 個(gè)陽性（6.7%），在大慶小于 1 歲的 154 小羊中發(fā)現(xiàn) 31 個(gè)陽性（20.1%），在齊齊哈爾小于1 歲的 148 只小羊中檢測到 24 個(gè)陽性（16.2%），在大于 1 歲的 23 只成年羊中發(fā)現(xiàn) 2 個(gè)陽性（8.7%），該研究近一步證實(shí)了各個(gè)年齡組的綿羊都可感染畢氏腸微孢子蟲。根據(jù)本研究得到的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，成年綿羊和小羊之間的感染率差異不顯著，但是大慶和齊齊哈爾集中飼養(yǎng)綿羊的感染率明顯高于哈爾濱散養(yǎng)綿羊的感染率。這可能是因?yàn)榧酗曫B(yǎng)的動物之間相互接觸的可能性更大，更容易導(dǎo)致畢氏腸微孢子蟲病的傳播。  

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結(jié)論 

（1）本研究在黑龍江省綿羊中檢測出能感染人的畢氏腸微孢子蟲基因型和十二指腸賈第蟲類群，表明這兩種病原在人和綿羊中存在相互傳播的風(fēng)險(xiǎn)。 
（2）基于畢氏腸微孢子蟲 ITS 基因位點(diǎn)分析，首次在綿羊中鑒定出 2 個(gè)對人有致病力的基因型 CS-4 和 Ebp C，及 3 個(gè)位于人獸共患組 1 中的新基因型（NESH1–NESH3），這些基因型均具有人獸共患潛力。 
（3）本研究發(fā)現(xiàn)，感染綿羊賈第蟲的類群為 E 和 A，其中類群 E 為感染綿羊的優(yōu)勢類群，類群 A 具有人獸共患潛力。 
（4）本研究鑒定出感染黑龍江省綿羊的隱孢子蟲蟲種為 C. xiaoi。 
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參考文獻(xiàn)(略)

本文編號：196226