發(fā)布時(shí)間：2016-10-23 08:25

第一章   文獻(xiàn)綜述

冷脅迫會(huì)嚴(yán)重的影響葉綠體的功能，對不同種類植物的光合作用造成不同程度的影響  (Holaday et al., 1992; Somersalo and Krause, 1990; Streb et al., 1997)，導(dǎo)致下游碳的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)受阻。然而對于抗冷植物，如擬南芥  (Strand et al., 1999, 2003)  和一些越冬作物  (Hurry et al., 1994, 1995; Sagisaka et al., 1991)，它們在低溫條件下生長數(shù)周之后仍然能夠恢復(fù)光合作用和碳的轉(zhuǎn)運(yùn)  (Lundmark  et  al., 2006)。對于長期在低溫條件下生長的草本植物來說，這種恢復(fù)光合作用的能力是必不可少的  (Ensminger et al., 2006; Stitt and Hurry, 2002)。所以葉綠體作為高等植物光合作用的場所，它們在低溫條件下正常的發(fā)育和運(yùn)轉(zhuǎn)對植物抗凍性尤為重要。在篩選到的 16 個(gè)基因中，有 4 個(gè)屬于葉綠體 RNA-binding 蛋白，其中 3 個(gè)已有相關(guān)報(bào)道，。ORRM1 參與擬南芥和玉米中質(zhì)體 RNA 的編輯，但是并沒有冷脅迫相關(guān)的研究；CP29A 和 CP31A 的突變體表現(xiàn)出冷敏感表型，它們調(diào)節(jié)擬南芥葉綠體轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)和加工。另外一個(gè) RNA-binding 蛋白基因，AT1G70200 還沒有被研究過，我們給它命名為 RBD1。本研究主要針對 RBD1，著重分析 RBD1對葉綠體 RNA 的調(diào)節(jié)作用，希望能為進(jìn)一步了解 RNP 在冷脅迫中的作用機(jī)制以及植物低溫適應(yīng)性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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第二章   擬南芥 rbd1 突變體冷敏感表型分析

2.1   材料和方法

為了更加深入的了解植物的抗冷機(jī)制，朱健康老師課題組從擬南芥生物技術(shù)中心  (Arabidopsis  Biological  Resource Center)訂購了 11,000 個(gè) T-DNA 插入突變體，這些突變體涵蓋了擬南芥基因組將近一半的基因。白戈博士對這些突變體進(jìn)行了冷敏感表型篩選  (Wang et al., 2016)，具體流程見圖 2.1。總共篩選到 52 個(gè)具有冷敏感表型的突變體，涉及到 49 個(gè)基因。其中有 16 個(gè)基因編碼的蛋白定位于葉綠體（附表 2.1，Unpublished data），這也進(jìn)一步說明葉綠體功能在冷脅迫中的重要性.在這 16 個(gè)基因當(dāng)中有 5 個(gè)基因編碼葉綠體 RNA 結(jié)合蛋白  (cpRNP)。在冷脅迫條件下，它們均表現(xiàn)出冷敏感的黃化表型。因此，，在接下來的研究中我將對這 5 個(gè) RNP 突變體一起進(jìn)行冷敏感表型分析。

2.2   結(jié)果與分析

然后，為了進(jìn)一步確定觀察到的冷敏感表型是否確實(shí)是由于 RBD1 缺失引起的，我們還克隆了RBD1 的 cDNA，分別構(gòu)建 p35S::RBD1 和 RBD1-RNAi 植物表達(dá)載體，并分別轉(zhuǎn)化 rbd1 突變體和 Col-0 野生型植株。在 22°C 正常生長條件下，rbd1-1，rbd1-2，RBD1-RNAi 以及 RBD1 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株與 Col-0 野生型相比沒有明顯表型上的差異，只是 rbd1-1 和 rbd1-2 突變體葉片輕微發(fā)黃  (圖 2.3D)。但是 22°C 正常條件下生長三周的擬南芥經(jīng)過 4°C 冷處理兩周之后，rbd1-1、rbd1-2 和RBD1-RNAi 植株的新生葉均開始表現(xiàn)出黃化的表型，四周時(shí)更為明顯  (圖 2.3D)。如果我們將黃化的植物重新轉(zhuǎn)移到正常生長條件下，僅需要兩天黃化的新葉就會(huì)重新變綠  (圖 2.3E)。此外，由于我們觀察到即使在 22°C 正常生長條件下，rbd1-1和 rbd1-2 突變體的葉片也會(huì)輕微發(fā)黃，所以測量其葉綠素含量，發(fā)現(xiàn) rbd1-1 和rbd1-2 突變體葉綠素含量確實(shí)顯著降低，而互補(bǔ)株系則和野生型 Col-0 沒有差異 (圖 2.3F)。以上結(jié)果表明：RBD1 缺失影響葉綠體功能，尤其在冷脅迫條件下可導(dǎo)致葉片黃化。

第三章   RBD1 基因表達(dá)及定位................ 39 

3.1   材料和方法 ..............39
3.2   結(jié)果與分析.............42
3.3   討論 ..........................45 
3.4   小結(jié) .....................46 
第四章   缺失 RBD1 影響葉綠體 23S rRNA 加工和翻譯 ................... 47 
4.1   材料和方法..........47
4.2   結(jié)果與分析 ..........50
4.3   討論 ...............................62 
4.4   小結(jié) .............................65 
第五章   結(jié)論 ............. 67

第四章   tZ-type Cytokinin 調(diào)節(jié)植物免疫力

4.1   材料和方法

對以上植物接種 Pst DC3000 菌株，分別在接種完 0 天和 3 天時(shí)檢測植株中細(xì)菌的濃度。0 天時(shí)它們之間并沒有明顯差異。接種 3 天后，噴灑 tZ-type 細(xì)胞分裂素的植物相對于噴灑空白對照和 iP-type 細(xì)胞分裂素的植物其免疫力都有顯著性增強(qiáng)，尤其是 abcg14-3snc1-1 的免疫水平幾乎達(dá)到 snc1-1 的水平  (圖 4.3B)。這說明，tZ-type 細(xì)胞分裂素不僅可以恢復(fù) abcg14-3snc1-1 的免疫力，還能增強(qiáng)植物的免疫力。 發(fā)現(xiàn)在 22°C 和 28°C條件下，外源噴灑 tZ-type 細(xì)胞分裂素可以恢復(fù) abcg14-3 單突變體的所有生長表型缺陷，這說明 abcg14-3 單突變體的生長表型缺陷確實(shí)是由于缺乏 tZ-type 細(xì)胞分裂素造成的。但 abcg14-3snc1-1 雙突變體的株型大小在 22°C 條件下并沒有得到恢復(fù)，僅在 28°C 條件下得到部分恢復(fù)，而 abcg14-3snc1-1 雙突變體的其它生長表型缺陷在 22°C 和 28°C 條件下都得到了恢復(fù)，如晚花，種子大小等。此外，我們意外的發(fā)現(xiàn)在22°C條件下噴灑tZ-type細(xì)胞分裂素使snc1-1單突變體變得更小，而且出現(xiàn)水漬化的表型，這些都是免疫力增強(qiáng)的表現(xiàn)。因此，  tZ-type 細(xì)胞分裂素對植物的生長有兩個(gè)方面的影響：第一，tZ-type 細(xì)胞分裂素影響植物的生長發(fā)育；第二，tZ-type 細(xì)胞分裂素影響植物的免疫反應(yīng)。但是 tZ-type 細(xì)胞分裂素介導(dǎo)的生長發(fā)育調(diào)節(jié)和植物免疫所影響的生長發(fā)育可能是兩個(gè)相互獨(dú)立的過程。 

4.2   結(jié)果與分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證 abcg14-3snc1-1 的表型缺陷是否是由于缺乏 tZ-type 細(xì)胞分裂素造成的，我們在 22°C 生長條件下對野生型 Col-0、snc1-1、abcg14-3 和abcg14-3snc1-1 噴灑 10μm 的 tZ-type 細(xì)胞分裂素。abcg14-3 在正常生長條件下表現(xiàn)出矮小的株型，但如果每天噴灑 10μm 的 tZ-type 細(xì)胞分裂素則可以恢復(fù)abcg14-3 的生長缺陷，使其表型與野生型 Col-0 相似  (圖 4.1A)。這說明 abcg14-3的生長缺陷確實(shí)是由于缺乏 tZ-type 細(xì)胞分裂素引起的�？闪钊速M(fèi)解的是，同樣每天噴灑10μm的tZ-type細(xì)胞分裂素卻無法恢復(fù)abcg14-3snc1-1的生長缺陷  (圖4.1A)。經(jīng)過仔細(xì)觀察，我們發(fā)現(xiàn)即便是 snc1-1 經(jīng)過噴灑后，植株也會(huì)變小并伴隨水漬化  (圖 4.1A)，這是免疫力增強(qiáng)的表現(xiàn)。因此,我們推測可能由于 snc1-1在 22°C 本身就具有很強(qiáng)的免疫反應(yīng)，abcg14-3snc1-1 在噴灑完 10μm 的 tZ-type細(xì)胞分裂素之后，可能首先恢復(fù)其免疫力，然后又進(jìn)一步增強(qiáng)，所以abcg14-3snc1-1 在噴灑完 10μm 的 tZ-type 細(xì)胞分裂素之后并沒有表現(xiàn)出變大的生長表型。
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第五章   結(jié)論 

1. int211 增強(qiáng) snc1-1 的生長缺陷，降低其免疫水平。 2. INT211 是一個(gè) tZ-type 細(xì)胞分裂素轉(zhuǎn)運(yùn)體基因 ABCG14。 3. ABCG14 調(diào)節(jié) SNC1 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。 4. ABCG14 調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育。 5. tZ-type 細(xì)胞分裂素調(diào)節(jié)植物免疫力。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號：150160