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《畜牧與獸醫(yī)雜志》2014年第六期

1材料與方法

1.1試劑及溶液硫酸阿米卡星注射液來(lái)自于上海恒豐強(qiáng)動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)為20121101;甲醇、乙腈(CNW公司)為色譜純;有機(jī)相針式濾器(0.45μm，CNW公司);WhatmanNo.4濾紙、GF/C玻璃纖維濾紙(上海利根商貿(mào)有限公司);進(jìn)樣瓶(CNW公司)。四硼酸二鈉緩沖劑:3.8g四硼酸二鈉溶于80mL蒸餾水中，用NaOH調(diào)pH至10.38后定容至100mL棕色容量瓶中，使用前用0.45μm的有機(jī)相針式濾器過(guò)濾。衍生化試劑:精密稱取OPA120mg，溶解于3mL甲醇中，加入15mL0.1mol•L－1的四硼酸二鈉溶液，加入150μL2－巰基乙醇，混勻，試劑室溫、暗處過(guò)夜處理，使用前過(guò)濾。阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:精密稱取阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)品1mg，加入1mL的水溶解混勻、過(guò)濾，配制為1mg•mL－1的阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。磷酸二氫鈉流動(dòng)相的配制:精密稱取磷酸二氫鈉7.80g，溶于800mL水中，用硼酸調(diào)pH至3.67后定容至1000mL的容量瓶中。使用前用真空抽濾機(jī)將溶液過(guò)濾，超聲脫氣備用。

1.2色譜條件色譜柱:inertsilODS－3V(5μm，4.6×150mm);保護(hù)柱;流動(dòng)相:甲醇:0.05mol•L－1磷酸二氫鈉(pH=3.67)(體積70∶30);熒光檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng)342nm，發(fā)射波長(zhǎng)440nm;流速1.0mL•min－1;柱溫:40℃。

1.3衍生反應(yīng)阿米卡星在0.5～50μg•mL－1的濃度范圍內(nèi)，通過(guò)測(cè)定不同OPA衍生劑的量、衍生時(shí)間對(duì)阿米卡星的影響，確定阿米卡星衍生的最佳條件。取阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋后的溶液200μL于進(jìn)樣瓶中，加入OPA衍生劑200μL，具塞震蕩混勻1min后取20μL進(jìn)樣。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液依次稀釋為0.5、1、2、5、8及20μg•mL－1這一系列濃度的溶液，取各個(gè)濃度的溶液200μL，按1.4的條件衍生后，取20μL進(jìn)樣檢測(cè)，并且重復(fù)3次取平均值。以阿米卡星的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并作回歸分析，得出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.5檢測(cè)限與定量限檢測(cè)限是反映分析方法整體的靈敏度的指標(biāo)，是從樣品背景信號(hào)中檢測(cè)出待測(cè)物質(zhì)存在時(shí)所需的最低濃度;定量限是樣品中待測(cè)物質(zhì)能夠被定量測(cè)定的最低量，結(jié)果具有準(zhǔn)確度和精確性。配制不同濃度阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)品溶液，添加到空白血漿中，按血漿樣品凈化的方法提取凈化，HPLC分析。以信噪比3∶1作為檢測(cè)限，以信噪比10∶1作為定量限。

1.6精密度與回收率精密量取適量空白血漿樣品，按照阿米卡星標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，分別配制含阿米卡星低、中、高(1、5及10μg•mL－1)三個(gè)濃度的血漿樣品，每個(gè)濃度按血漿樣品預(yù)處理方法處理后，重復(fù)進(jìn)樣5次，取平均值計(jì)算提取回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(ＲSD)和日內(nèi)變異系數(shù)，同時(shí)每份樣品1周內(nèi)連續(xù)測(cè)定5d，計(jì)算日間變異系數(shù)。

1.7血液樣品的凈化取保存于－20℃冰箱內(nèi)的血漿樣品，溶解回溫后精密量取血漿樣品200μL于離心管內(nèi)，加入pH10.38的四硼酸二鈉緩沖液200μL，漩渦混合后，加入乙腈400μL，漩渦震蕩1min，1200r•min－1離心10min，取上清液200μL待用。

1.8給藥和采樣選擇健康成年混血犬8只，體重約為10kg，并在試驗(yàn)前，所有犬只至少飼養(yǎng)7d，且在試驗(yàn)前沒(méi)有使用過(guò)任何會(huì)影響阿米卡星代謝的藥物，整個(gè)試驗(yàn)期間，嚴(yán)密觀察各犬的精神狀態(tài)和臨床反應(yīng)，包括食欲、飲欲、大小便情況以及可能出現(xiàn)的胃腸道等方面的不良反應(yīng)。試驗(yàn)時(shí)，稱重后，皮下注射硫酸阿米卡星，給藥劑量為10mg•kg－1，于給藥前0.5h，給藥后5、10、15及30min和1、2、4、8、12、24、48、72及96h頸靜脈采血，所有樣品采血后離心，取血漿，進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)定。

1.9血－藥濃度數(shù)據(jù)的處理根據(jù)血漿藥物濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)，做藥時(shí)曲線圖，藥時(shí)曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖均采用Excel軟件繪制。運(yùn)用SPSS18.0軟件中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和中國(guó)藥理學(xué)會(huì)編制的3P97軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并給出最可能的房室模型，統(tǒng)計(jì)值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2結(jié)果

2.1阿米卡星的色譜按照1.3的色譜條件，所得空白血漿、阿米卡星血漿樣品、阿米卡星血漿樣品加標(biāo)色譜見(jiàn)圖1－圖3。結(jié)果表明:高效液相色譜法基線走勢(shì)平穩(wěn)，阿米卡星出峰時(shí)間大約為10.046min，其中血液樣品經(jīng)過(guò)凈化后，雜峰較少，雜峰目標(biāo)峰分離較好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不會(huì)干擾主峰阿米卡星的分離。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線以峰面積為縱坐標(biāo)，以待測(cè)樣品的濃度為橫坐標(biāo)，以加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，所得阿米卡星溶液濃度在0.5～100μg•mL－1之間，線性關(guān)系良好，回歸方程為y=10008x+24570，相關(guān)系數(shù)Ｒ2=0.997，阿米卡星的定量限0.5μg•mL－1，最低檢測(cè)濃度達(dá)到0.2μg•mL－1。標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖4。2.3阿米卡星精密度和提取回收率的測(cè)定當(dāng)血漿樣品中添加的阿米卡星的濃度分別為1、5及10μg•mL－1時(shí)，其提取回收率(n

=5)分別為(91.41±8.78)%、(93.56±6.16)%及(95.58±4.81)%。結(jié)果表明:本試驗(yàn)條件下所用方法的精密度符合要求，測(cè)定方法可靠。當(dāng)血漿樣品中添加的阿米卡星的濃度分別為1、5及10μg•mL－1時(shí)，其日內(nèi)變系數(shù)(n=5)分別為6.68%、5.54%及5.24%，，日間變異系數(shù)(n=5)分別為7.36%、5.94%及5.64%。結(jié)果表明:本試驗(yàn)條件下所用方法的精密度符合要求，測(cè)定方法可靠。

2.4阿米卡星在犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征各組犬按10mg•kg－1單劑量皮下注射阿米卡星后，將不同的時(shí)間點(diǎn)所得血漿樣品經(jīng)過(guò)處理后進(jìn)行分析，所得血藥濃度變化見(jiàn)下表。根據(jù)血漿藥物濃度時(shí)間數(shù)據(jù)，采用Excel軟件繪制藥－時(shí)曲線，見(jiàn)圖6。由結(jié)果可知，血漿中阿米卡星濃度的達(dá)峰時(shí)間為給藥后0.5～1h，阿米卡星的血藥濃度在給藥后2h后開(kāi)始下降。

2.5犬單劑量皮下注射阿米卡星后的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)采用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)編3P97軟件將上述實(shí)測(cè)所得的藥時(shí)濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，行擬合優(yōu)度值(odness－of－fitvalue)比較，利用AIC最小值原則結(jié)合F檢驗(yàn)法得出最佳房室模型。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，犬單劑量皮下組織阿米卡星在犬體內(nèi)的代謝過(guò)程符合一級(jí)吸收二室開(kāi)放的藥代動(dòng)力學(xué)模型，其中權(quán)重系數(shù)為1/C。同時(shí)運(yùn)用梯形面積法計(jì)算并得到A、Tmax、AUC、Cmax等主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，具體見(jiàn)表1。在本試驗(yàn)的條件下，犬在10mg•kg－1單劑量皮下注射阿米卡星之后的藥物濃度達(dá)峰時(shí)間(Tmax)為(0.886±0.06)h，峰濃度(Cmax)為(31.35±1.41)μg•mL－1，血漿中阿米卡星的T1/2β(消除半衰期)為(1.779±0.13)h，這表明阿米卡星為短效消除藥物;阿米卡星的藥時(shí)曲線下面積(AUC)為(104.9±8.46)μg•h•mL－1，這表明阿米卡星在犬體內(nèi)分布廣泛，代謝、消除時(shí)間短。本試驗(yàn)所選用的測(cè)定血漿內(nèi)的阿米卡星濃度的高校液相分析方法能滿足對(duì)阿米卡星的臨床效果的評(píng)價(jià)要求，具有準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)。

3討論

阿米卡星是卡那霉素A在C－1的氨基上引入α－羥基－γ－氨基丁酸得到的，其具有極性強(qiáng)、水溶性大和無(wú)揮發(fā)性等特點(diǎn)，且缺少紫外吸收基團(tuán)，因此采用紫外檢測(cè)具有一定的難度。但阿米卡星在結(jié)構(gòu)上具有活潑基團(tuán)(氨基)，因此可以利用這個(gè)特征，使阿米卡星與衍生化試劑進(jìn)行反應(yīng)而成在紫外區(qū)間有吸收或有熒光的物質(zhì)，即可利用紫外或熒光進(jìn)行檢測(cè)。阿米卡星在有2－巰基乙醇存在、pH為9～11的條件下，伯胺基化合物可作為親核試劑與OPA發(fā)生反應(yīng)生成1－硫代－2－烷基異吲哚，試劑過(guò)量2～3個(gè)數(shù)量級(jí)的情況下可在數(shù)秒內(nèi)完成，且過(guò)量的衍生化試劑不影響HPLC的測(cè)定結(jié)果。由于OPA衍生化試劑信號(hào)很快衰減，故本試驗(yàn)采用柱前衍生法進(jìn)行衍生。去除血漿中蛋白的方法有無(wú)水乙醇沉淀法、磺基水楊酸沉淀法、乙腈沉淀法和三氯乙酸沉淀法等。由于OPA衍生時(shí)的最佳pH值為10.4，而水楊酸和磺基乙酸沉淀法會(huì)改變血液樣品的pH值從而會(huì)影響衍生程度，因此參考相關(guān)文獻(xiàn)，在血液樣本的處理上采用乙腈沉淀蛋白時(shí)血漿與乙腈的體積比為1∶2時(shí)即能除去95%的蛋白質(zhì)，故在試驗(yàn)中采用了乙腈沉淀法。

在衍生反應(yīng)條件的優(yōu)化上主要考察了濃度一定的情況下，OPA的體積對(duì)反應(yīng)程度的影響，結(jié)果表明OPA衍生劑與阿米卡星進(jìn)行衍生反應(yīng)的最適濃度為1∶1(V/V)。皮下注射硫酸阿米卡星后，盡管跟相關(guān)參考文獻(xiàn)的給藥劑量相同，但T1/2α和T1/2β均大于文獻(xiàn)報(bào)道的小獵犬(分別為0.472h和1.193h)和灰狗(分別為0.476h和1.220h)的，V/F比小獵犬(0.229L•kg－1)和灰狗(0.241h)的小，這表明犬皮下注射硫酸阿米卡星后吸收完全且較迅速，消除較緩慢。本試驗(yàn)中Tmax和Cmax均比小獵犬(分別為0.671h和25.86μg•mL－1)和灰狗(分別為0.640h和27.40μg•mL－1)的大，說(shuō)明硫酸阿米卡星在混血犬體內(nèi)經(jīng)皮下注射后其達(dá)峰時(shí)間比小獵犬和灰狗長(zhǎng)，但峰濃度高。硫酸阿米卡星在動(dòng)物體內(nèi)的代謝與動(dòng)物品種有關(guān)，即藥代動(dòng)力學(xué)特征差異大。也有文獻(xiàn)顯示同樣品種不同給藥途徑，硫酸阿米卡星在動(dòng)物體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)也會(huì)出現(xiàn)明顯差異。因此在獸醫(yī)臨床用藥中應(yīng)根據(jù)不同動(dòng)物、不同品種的具體藥代動(dòng)力學(xué)特征、甚至對(duì)具體的給藥方式也需要進(jìn)行評(píng)估來(lái)制定給藥方案，從而避免產(chǎn)生毒副作用。

作者：唐龍琴周闖孫一涵張海彬單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院

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