本文關(guān)鍵詞：影像科學(xué)與光化學(xué)雜志，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《影像科學(xué)與光化學(xué)》2016年第3期

摘要：

通過觀察生物體內(nèi)骨的電鏡圖片，發(fā)現(xiàn)骨表面具有豐富的纖維微納結(jié)構(gòu)，在此觀測的啟發(fā)下，本實驗設(shè)計將二氧化鈦表面生物活性化的同時構(gòu)筑這種纖維微納結(jié)構(gòu)，模仿骨表面。考慮到二氧化鈦具有光催化性，且具有生物無毒性，本實驗采用“自上而下”的一步法，在紫外光照的條件下，將二氧化鈦靜電紡絲與透明質(zhì)酸衍生物在光照條件下通過雙鍵穩(wěn)定地連接起來。傅立葉－紅外光譜分析表明實驗成功地在二氧化鈦靜電紡絲表面嫁接上透明質(zhì)酸分子。通過熒光和掃描電鏡分析表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可以很好地在二氧化鈦靜電紡絲和透明質(zhì)酸的復(fù)合結(jié)構(gòu)上生長。這種構(gòu)筑復(fù)合結(jié)構(gòu)表面的方法，生物活化了二氧化鈦紡絲的表面，同時模仿骨表面獲得了微納纖維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。此外，可以將二氧化鈦靜電紡絲紡在不同種類的材料表面，從而在不同材料表面簡便地得到可用于細(xì)胞培養(yǎng)的纖維表面結(jié)構(gòu)，對于未來可實際應(yīng)用的移植材料研發(fā)具有很好的借鑒意義。

關(guān)鍵詞：

二氧化鈦靜電紡絲；透明質(zhì)酸；紫外光引發(fā)；細(xì)胞培養(yǎng)

時至今日，研究生物體系與材料界面的作用機(jī)理和規(guī)律成為了組織醫(yī)學(xué)工程的重要課題。根據(jù)眾多的科學(xué)文獻(xiàn)報道，微納圖案化材料在組織醫(yī)學(xué)工程、人工生物體內(nèi)移植材料等領(lǐng)域中都有了廣泛的應(yīng)用，對人工體內(nèi)骨移植、人造血管、牙齒種植等方面都具有重大的推進(jìn)作用�，F(xiàn)在，來自多個領(lǐng)域的科研工作者將從不同的研究領(lǐng)域和角度共同探討研究生物體內(nèi)外的各種生物界面組成。在眾多研究中，具有微納結(jié)構(gòu)的人工移植材料具有刺激并調(diào)控細(xì)胞行為的作用，這些微納結(jié)構(gòu)很好地加強(qiáng)了材料與組織的相容性，具有很強(qiáng)的應(yīng)用價值。有關(guān)的一系列工作包括構(gòu)筑特殊的微納圖案化表面誘導(dǎo)干細(xì)胞的定向分化；利用特殊的圖案化基底在體外培養(yǎng)體細(xì)胞，使其恢復(fù)并具有多能分化性，最終成為多功能干細(xì)胞用于體內(nèi)的疾病治療、器官組織恢復(fù)；將體內(nèi)移植材料表面上構(gòu)筑特殊的微納圖案化結(jié)構(gòu)，使體內(nèi)細(xì)胞在移植材料表面的黏附更加順暢，并減少機(jī)體因移植物而出現(xiàn)的免疫排斥現(xiàn)象，達(dá)到促進(jìn)組織與材料相容性的目的［１－４］。但是，微納結(jié)構(gòu)的表面構(gòu)筑具有成本高、耗時長、可構(gòu)筑范圍有限等諸多不利因素，同時用于移植的材料本身在無生物毒性以外，還需要具有較好的生物相容性，比如眾多金屬移植材料的機(jī)械強(qiáng)度很好，但是具有生物毒性，聚合物材料聚醚醚酮具有生物無毒性且表面的力學(xué)性質(zhì)與骨表面相似，但是材料本身卻具有生物惰性�？紤]到以上眾多問題，本實驗設(shè)想在構(gòu)筑微納結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上改性材料表面的性質(zhì)，使細(xì)胞更易在材料表面黏附、增殖，完成一系列的生物行為。

本文工作采用原位聚合的方法將接有雙鍵的透明質(zhì)酸（透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯）構(gòu)筑在二氧化鈦靜電紡絲的表面，選�。祝椋螅簦幔虼笫蟮拈g充質(zhì)干細(xì)胞作為實驗用細(xì)胞來評價所研究材料的生物相容性。透明質(zhì)酸是生物體內(nèi)一種常見的生物大分子，在細(xì)胞外基質(zhì)中廣泛存在［５－８］，考慮到二氧化鈦具有光催化性，且具有生物無毒性，我們在紫外光照的條件下通過“自上而下”一步法，將二氧化鈦靜電紡絲、透明質(zhì)酸衍生物兩者用化學(xué)鍵穩(wěn)定地連接起來。這種構(gòu)筑復(fù)合結(jié)構(gòu)表面的方法，生物活化了二氧化鈦靜電紡絲的表面，，同時模仿骨表面獲得了微納纖維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。此外，可以將二氧化鈦靜電紡絲紡在不同種類的材料表面，從而在不同材料表面簡便地得到可用于細(xì)胞培養(yǎng)的纖維表面結(jié)構(gòu)，對于未來可實際應(yīng)用的移植材料研發(fā)具有很好的借鑒意義。

１實驗部分

１．１試劑與儀器

去離子水，透明質(zhì)酸鈉（上海拜力生物科技公司），甲基丙烯酸酐（西格瑪奧德里奇），聚乙烯吡咯酮，鈦酸四丁酯（麥克林），醋酸（９９％，阿拉�。�，１×ＰＢＳ，丙酮（分析純，北京化工廠），乙醇（分析純，北京化工廠），過硫酸銨（ＡＰＳ）（阿拉�。�，牛血清白蛋白（ＢＳＡ）（西格瑪奧德里奇），鬼筆環(huán)肽，ＤＡＰＩ，氫氧化鈉（分析純，上海阿拉�。下热ǚ治黾�，北京化工廠），戊二醛（分析純，北京化工廠），青霉素－鏈霉素（簡稱雙抗，Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），ＤＭＥＭ－Ｆ１２培養(yǎng)基（Ｇｉｂｃｏ），胎牛血清（Ｇｉｂｃｏ），胰蛋白酶（０．２５％，Ｈｙｃｌｏｎｅ）。高壓電源（東文天津有限公司），馬弗爐（安賽斯北京科技有限公司），傅里葉紅外光譜儀，ＣＯ２臨界點干燥儀，微電子天平，環(huán)境掃描電子顯微鏡，原子力顯微鏡，二氧化碳培養(yǎng)箱，熒光倒置顯微鏡（尼康），單光子激光共聚焦顯微鏡（蔡司），超凈工作臺，高壓蒸汽滅菌鍋，制冰機(jī)，全自動酶標(biāo)儀，紫外燈。

１．２合成透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯

將透明質(zhì)酸鈉配制成１％質(zhì)量濃度的溶液（所用溶劑為去離子水），向配制好的溶液中加入額外１０倍體積的甲基丙烯酸酐，將溶液體系的ｐＨ調(diào)整為８左右，混合后的體系使用透析袋（分子量６～８ｋＤａ）進(jìn)行純化，得到的目標(biāo)產(chǎn)物使用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，得到白色類棉花的絮狀物，這些絮狀物就是透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯［９，１０］。將最終產(chǎn)物溶于去離子水制備成２％質(zhì)量濃度的溶液待用。

１．３制備二氧化鈦靜電紡絲薄膜

將分子量為1300000的聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）０．３ｇ放入帶有磁力攪拌子的潔凈的小錐形瓶中，加入５ｍＬ無水乙醇，加蓋封閉并進(jìn)行磁力攪拌直到得到均一透明的液體。將３ｍＬ鈦酸四丁酯和５ｍＬ冰醋酸同時緩慢滴加到小錐形瓶中，經(jīng)過２ｈ的磁力攪拌后會得到均一澄清的黃色液體。將黃色液體移入用于電紡的注射器中，注射器所配備的針頭為０．７ｍｍ的鋼制針頭。針頭與承接電紡絲的硅片距離為１２ｃｍ，注射泵的推進(jìn)速度為０．５ｍＬ•ｈ－１，加載在兩端的電壓為１５ＫＶ，經(jīng)過５ｈ的電紡，得到含有ＰＶＰ和鈦酸四丁酯的靜電紡絲薄膜。將靜電紡絲薄膜與硅片一起放入馬弗爐中，在５００℃的溫度下煅燒２ｈ，得到二氧化鈦靜電紡絲薄膜［１１］。硅片上的薄膜可以用鑷子輕輕揭起，密封保存。薄膜很薄需要小心處理，很容易發(fā)生斷裂。

１．４制備透明質(zhì)酸和二氧化鈦靜電紡絲的復(fù)合結(jié)構(gòu)

將透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯溶液作為工作液，向覆蓋有二氧化鈦靜電紡絲的硅片表面滴加工作液至覆蓋表面，置于１０００Ｗ紫外燈下照射４ｍｉｎ，工作距離５ｃｍ。由于二氧化鈦靜電紡絲具有光引發(fā)性［１２］，在紫外光的照射激發(fā)下，會使其在表面產(chǎn)生自由基，從而與周圍帶有雙鍵的透明質(zhì)酸單體發(fā)生聚合反應(yīng)，使兩者穩(wěn)定的連接在一起。將紫外光照射后的樣品取出使用去離子水清洗３遍，每遍３ｍｉｎ，洗掉沒有反應(yīng)的單體，如圖１所示。清洗后，使用氮氣吹干以備待用。對于用于細(xì)胞實驗的樣品，將其高壓滅菌或者使用低功率紫外燈照射５ｈ左右。

１．５表面性質(zhì)檢測制得的樣品

使用傅里葉紅外光譜儀在７００～４０００ｃｍ－１的范圍內(nèi)，４．０ｃｍ－１分辨率下進(jìn)行檢測。表面圖像使用環(huán)境掃描電子顯微鏡（ＥＳＥＭ）在低真空模式下進(jìn)行檢測，加載的電壓為８ｋＶ，樣品在測試前要提前蒸鍍上２ｎｍ左右厚度的鉑金層加強(qiáng)導(dǎo)電性。

１．６鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

將提取細(xì)胞所使用的器械進(jìn)行高壓滅菌處理，超凈臺在使用前利用紫外燈殺菌４０ｍｉｎ，�。叮啊福埃缧坌裕祝椋螅簦幔虼笫�，對大鼠腹腔內(nèi)注射５％水合氯醛２．５ｍＬ，待老鼠麻醉不動后將其斷頸處死。在超凈臺中，利用剪刀剪取其雙側(cè)股骨和脛骨并使用針管提取骨髓，將提取出的骨髓過濾至１５ｍＬ離心管中。在以１３００轉(zhuǎn)／ｍｉｎ的速度離心后，將其分散到配備好的ＤＭＥＭ－Ｆ１２培養(yǎng)基中（１５％胎牛血清，１％雙抗），放于細(xì)胞培養(yǎng)箱（５％ＣＯ２，３７℃）中進(jìn)行培養(yǎng)。第二天全換液，換掉雜質(zhì)細(xì)胞，第４天全換液替換掉雜質(zhì)細(xì)胞，然后通過觀察細(xì)胞的成長情況，每２天換一次液。細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿后，使用胰酶進(jìn)行傳代，當(dāng)細(xì)胞傳代到第４代時可以使用，接種到材料表面進(jìn)行后續(xù)試驗。將修飾有二氧化鈦靜電紡絲和透明質(zhì)酸衍生物的硅片放入２４孔培養(yǎng)板中，每個孔中加入１ｍＬ消化下來的細(xì)胞懸浮液（５００００細(xì)胞／ｍＬ），將孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱（５％ＣＯ２，３７℃）進(jìn)行培養(yǎng)，每２天換一次液［１，１３］。

１．７基底細(xì)胞掃描電鏡分析

將上述細(xì)胞培養(yǎng)２４ｈ后的不同基底從孔板中取出，使用ＰＢＳ清洗表面一次除去多余培養(yǎng)基，使用５％戊二醛固定樣品，浸泡不同基底過夜，固定后使用ＰＢＳ清洗基底３次，一次２ｍｉｎ除去多余的戊二醛；清洗后的樣品使用３０％、５０％、７５％、８０％、９５％、１００％濃度的酒精進(jìn)行梯度脫水，每個濃度的脫水時間１５ｍｉｎ到２０ｍｉｎ，梯度脫水后保存在無水乙醇中；將保存在無水乙醇中的樣品轉(zhuǎn)移至ＣＯ２臨界點干燥儀中進(jìn)行干燥；干燥后的樣品使用環(huán)境掃描電鏡進(jìn)行表面分析。

１．８基底細(xì)胞熒光分析

將間充質(zhì)干細(xì)胞接種在不同的基底表面２４ｈ后，樣品用ＰＢＳ清洗１０ｍｉｎ，除去表面多余的培養(yǎng)基；樣品使用４％的多聚甲醛固定１５ｍｉｎ，固定后用ＰＢＳ清洗３遍，每遍１０ｍｉｎ，以除去多余的多聚甲醛；清洗完后樣品用０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００在室溫條件下破膜，破完膜后用ＰＢＳ清洗３遍，每遍５ｍｉｎ；使用１％的牛血清白蛋白在室溫條件下對樣品封閉２ｈ，封閉后使用ＰＢＳ清洗３遍，每遍５ｍｉｎ；將清洗過的樣品使用鬼筆環(huán)肽（儲備液１∶４０，用ＰＢＳ稀釋后使用），在避光處進(jìn)行細(xì)胞骨架染色４０ｍｉｎ，染色后使用ＰＢＳ清洗３遍，每遍５ｍｉｎ，清除多余的染料；使用ＤＡＰＩ（儲備液１∶１００稀釋）染色細(xì)胞核１０ｍｉｎ，染色后使用ＰＢＳ清洗３遍，每遍５ｍｉｎ；染色后的樣品保存到甘油或直接使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀測［１］。

２結(jié)果與討論

２．１紅外吸收光譜

二氧化鈦具有自引發(fā)性，在紫外光照條件下會產(chǎn)生活性自由基團(tuán)并與透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯所帶有的雙鍵基團(tuán)發(fā)生加成反應(yīng)［１４］，經(jīng)過紫外照射４ｍｉｎ后二氧化鈦靜電紡絲就會通過化學(xué)鍵穩(wěn)定地嫁接在親水的透明質(zhì)酸分子鏈上。傅里葉紅外光譜儀的測量用來描述基底表面的分子嫁接情況，如圖２所示，在３３７０ｃｍ－１附近有很強(qiáng)的吸收峰，這正是由羧基引起的。這些數(shù)據(jù)表明透明質(zhì)酸成功地修飾在二氧化鈦靜電紡絲上。

２．２二氧化鈦靜電紡絲和透明質(zhì)酸纖維復(fù)合結(jié)構(gòu)掃描電鏡

為了評價修飾透明質(zhì)酸后的二氧化鈦靜電紡絲的表面形貌特性，我們對修飾后的表面進(jìn)行掃描電鏡的觀測。圖３（ａ）是修飾后的二氧化鈦靜電紡絲表面，與圖３（ｂ）的真實骨表面比較我們會發(fā)現(xiàn)，真實骨表面充斥著豐富的纖維結(jié)構(gòu)，修飾后的二氧化鈦靜電紡絲纖維結(jié)構(gòu)很好的模仿了這一點。我們知道基底的納米結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的形貌不對稱會促進(jìn)細(xì)胞的極化現(xiàn)象，而細(xì)胞的極化會促進(jìn)細(xì)胞的分化趨勢，我們有理由相信修飾后的二氧化鈦靜電紡絲纖維結(jié)構(gòu)表面能夠很好地促進(jìn)細(xì)胞分化的趨勢［１５－１７］。

２．３細(xì)胞電鏡圖片

對細(xì)胞的骨架和細(xì)胞核進(jìn)行雙染色，利用環(huán)境掃描電鏡對間充質(zhì)干細(xì)胞在不同基底的細(xì)胞形態(tài)學(xué)情況進(jìn)行了分析。如圖４所示，在修飾后的二氧化鈦靜電紡絲表面上細(xì)胞鋪展情況很好，通過掃描電鏡圖片觀察可以發(fā)現(xiàn)纖維結(jié)構(gòu)上的細(xì)胞偽足（包括板狀偽足、絲狀偽足）充分鋪展。偽足的鋪展情況直接影響細(xì)胞的穩(wěn)定粘附、遷移、分化等細(xì)胞行為，對于偽足黏附情況較差的材料，無疑在細(xì)胞應(yīng)用方面也是極其不利的，而細(xì)胞的偽足在修飾有透明質(zhì)酸的二氧化鈦紡絲結(jié)構(gòu)表面鋪展情況很好，這證明了生物活性化的二氧化鈦靜電紡絲表面能夠提供給細(xì)胞更多的黏附位點，也可以認(rèn)為仿骨表面的納米纖維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)從結(jié)構(gòu)角度講具有促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化的作用。

２．４細(xì)胞熒光圖片

如圖５所示，通過觀察熒光圖片可以發(fā)現(xiàn)，接種在二氧化鈦靜電紡絲和透明質(zhì)酸纖維復(fù)合結(jié)構(gòu)上的細(xì)胞核和骨架的熒光圖像很明顯，骨架與核的輪廓很清晰，這說明細(xì)胞在纖維結(jié)構(gòu)表面的生長狀況良好，而且細(xì)胞的核與骨架具有很高的長徑比，這主要是由于二氧化鈦靜電紡絲的表面富含不對稱的納米纖維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，較高的長徑比使得細(xì)胞骨架更加容易發(fā)生極化現(xiàn)象，而極化現(xiàn)象的產(chǎn)生會加速細(xì)胞的分化程度，使得干細(xì)胞在表面的成骨分化導(dǎo)向更加強(qiáng)烈［１８］。通過數(shù)據(jù)分析有理由相信，二氧化鈦靜電紡絲和透明質(zhì)酸纖維復(fù)合結(jié)構(gòu)具有生物相容性的同時還具有促干細(xì)胞成骨分化的能力。

３結(jié)論

本文采用“自上而下”的一步構(gòu)筑法，在紫外照射條件下成功地將二氧化鈦靜電紡絲與生物活性分子透明質(zhì)酸結(jié)合起來。生物活性分子的修飾大大提高了細(xì)胞在靜電紡絲表面的黏附、鋪展、增殖等生物行為，此外，二氧化鈦靜電紡絲自有的納米纖維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)極大的促進(jìn)了間充質(zhì)干細(xì)胞的分化導(dǎo)向，同時由于制作方法簡單使得這種構(gòu)筑手段可以應(yīng)用于各種生物活性較差移植材料表面。本文的工作成功地構(gòu)筑了具有生物活性的納米纖維結(jié)構(gòu)，并且引入了納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可以用于改善生物惰性問題，在力學(xué)與納米結(jié)構(gòu)的復(fù)合作用下能夠更好地促進(jìn)干細(xì)胞的分化導(dǎo)向，而且使用的一步構(gòu)筑方法操作簡便，對于移植材料的表面構(gòu)筑具有一定借鑒意義。

作者:劉思迪 張俊虎 單位:吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院超分子結(jié)構(gòu)與材料國家重點實驗室

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