本文關(guān)鍵詞：黃花蒿中黃酮類化合物生物合成AaF3H和AaFLS基因克隆與功能鑒定

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【摘要】：黃花蒿(Artemisia annua L.)為一年生草本植物,其主要活性物質(zhì)青蒿素已被世界衛(wèi)生組織作為治療瘧疾的首推物質(zhì)。但從2008年世界各地尤其是東南亞地區(qū)和非洲地區(qū)陸續(xù)報道了青蒿素耐藥性的案例以來,青蒿素耐藥性問題已成為全球關(guān)注的焦點。近年研究表明,黃花蒿中許多次生代謝產(chǎn)物具有協(xié)同增強青蒿素藥效的功能,尤其是黃酮類化合物不僅是實現(xiàn)此協(xié)同效應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì),而且還能夠減緩瘧原蟲耐藥性的進(jìn)化并且阻止青蒿素耐藥性的產(chǎn)生。然而當(dāng)前相關(guān)研究主要集中于黃酮類化合物的生物活性和對青蒿素抗瘧疾的協(xié)同增效作用等方面,而鮮見黃酮類化合物在黃花蒿中的生物合成途徑等研究。為此,本研究在成功克隆黃花蒿中黃酮類化合物兩個關(guān)鍵合成酶基因的基礎(chǔ)上,對其在大腸桿菌E.Coli(BL21)DE3中的原核表達(dá)以及兩個酶的體外純化、酶活性和功能進(jìn)行了系統(tǒng)研究,以期為后續(xù)黃花蒿中青蒿素與黃酮類化合物在生物合成途徑、協(xié)同增效功能以及阻止青蒿素耐藥性產(chǎn)生及發(fā)展等方面的關(guān)聯(lián)研究提供參考。主要研究結(jié)果如下：1、以黃花蒿幼嫩芽葉為材料,提取總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,應(yīng)用PCR技術(shù)克隆了黃花蒿中黃烷酮3-羥化酶(AaF3H)基因ORF,該序列包含一個完整的編碼區(qū)1095 bp,編碼364個氨基酸組成的蛋白。該蛋白的分子量為41.18 KDa,等電點為5.67。該AaF3H基因編碼蛋白與銀杏、擬南芥、茶樹和柚子中的F3H編碼蛋白相比,分別具有67%、76%、77%和78%的相似性。將AaF3H基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a,并采用原核表達(dá)的方式在大腸桿菌E.Coli (BL21) DE3中進(jìn)行了融合表達(dá)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到融合蛋白,重組大腸桿菌在IPTG終濃度為0.5mM、誘導(dǎo)溫度28℃、誘導(dǎo)時間8h條件下表達(dá)效果較好。2、提取表達(dá)的AaF3H重組蛋白并利用Ni-NTA親和柱色譜法對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化,通過體外酶促反應(yīng)發(fā)現(xiàn)該重組蛋白具有轉(zhuǎn)化(2S)-黃烷酮為(2R,3R)-二氫黃酮醇的羥基化能力,能夠催化底物(2S)柚皮素轉(zhuǎn)化為(2R,3R)-二氫山奈酚。酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)其反應(yīng)最優(yōu)pH為8.5,反應(yīng)溫度35℃,在此參數(shù)條件下AaF3H在體外具有最強的催化活性,以柚皮素為底物時Km為164.35μM。3、以黃花蒿幼嫩芽葉cDNA為原料,應(yīng)用PCR技術(shù)克隆了黃花蒿中黃酮醇合酶(AaFLS)基因ORF,該序列包含一個完整的編碼區(qū)1008 bp,編碼335個氨基酸組成的蛋白,該蛋白的分子量為37.85KDa,等電點為5.32。該AaFLS基因編碼蛋白與黑心金光菊、三花龍膽、煙草、馬鈴薯中的FLS編碼蛋白相比,分別具有86%、74%、74%、73%的相似性。將AaFLS基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a,并采用原核表達(dá)的方式在大腸桿菌E.Coli (BL21) DE3中進(jìn)行了融合表達(dá)。重組大腸桿菌在IPTG終濃度為0.5mM、誘導(dǎo)溫度28℃、誘導(dǎo)時間8h條件下表達(dá)效果較好。4、提取表達(dá)的AaFLS蛋白并利用Ni-NTA親和柱色譜法對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化,體外酶促反應(yīng)發(fā)現(xiàn)該蛋白具有轉(zhuǎn)化(2R,3R)-二氫黃酮醇為黃酮醇的能力,能催化底物(2R,3R)-二氫山奈酚轉(zhuǎn)化為山奈酚,其酶促反應(yīng)最優(yōu)pH為7.5,反應(yīng)溫度23℃,在這此參數(shù)條件下,該酶具有最強的催化活性,以(2R,3R)-二氫山奈酚為底物時Km為127.49μM。
【關(guān)鍵詞】：黃花蒿 黃酮類化合物 合成酶基因 基因克隆 功能鑒定
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2;S567.219
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮寫詞(Abbreviation)8-15
• 第一章 緒論15-25
• 1 黃花蒿青蒿素抗瘧疾研究進(jìn)展15-20
• 1.1 黃花蒿15-16
• 1.2 青蒿素抗瘧疾作用16-17
• 1.2.1 青蒿素抗瘧疾機制17
• 1.3 青蒿素其他作用17-18
• 1.4 青蒿素的耐藥性18-20
• 2 黃花蒿黃酮類化合物研究進(jìn)展20-24
• 2.1 黃花蒿黃酮類化合物及其生物活性20-21
• 2.2 黃花蒿黃酮類化合物協(xié)同青蒿素抗瘧疾作用21-22
• 2.3 黃花蒿黃酮類化合物的生物合成22-24
• 2.3.1 黃烷酮3-羥化酶基因(F3H)22-23
• 2.3.2 黃酮醇合酶基因(FLS)23-24
• 3 研究目的與意義24
• 4 研究內(nèi)容24-25
• 第二章 黃花蒿黃烷酮3-羥化酶(AaF3H)基因克隆及原核表達(dá)25-37
• 1 材料與方法25-31
• 1.1 材料25-27
• 1.1.1 黃花蒿原料25
• 1.1.2 主要儀器設(shè)備25-26
• 1.1.3 主要試劑26
• 1.1.4 溶液配制26-27
• 1.2 方法27-31
• 1.2.1 黃花蒿RNA的提取27
• 1.2.2 黃花蒿RNA逆轉(zhuǎn)錄27-28
• 1.2.3 AaF3H基因克隆28
• 1.2.4 AaF3H基因原核表達(dá)28-30
• 1.2.5 AaF3H重組蛋白分離純化及濃縮30-31
• 1.2.6 AaF3H基因的核苷酸和氨基酸序列分析31
• 2 結(jié)果與分析31-37
• 2.1 黃花蒿RNA提取31
• 2.2 AaF3H基因的PCR克隆31-32
• 2.3 AaF3H基因原核表達(dá)32-34
• 2.3.1 AaF3H-T重組質(zhì)粒菌落PCR檢測32
• 2.3.2 AaF3H-T重組質(zhì)粒雙酶切32-33
• 2.3.3 AaF3H-pET28a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α菌落PCR檢測33
• 2.3.4 轉(zhuǎn)化了AaF3H-pET28a重組質(zhì)粒的BL21誘導(dǎo)表達(dá)體系SDS-PAGE檢測33-34
• 2.4 AaF3H重組蛋白分離純化及濃縮34-35
• 2.5 AaF3H基因的核苷酸和氨基酸序列分析35
• 2.6 小結(jié)35-36
• 2.7 討論36-37
• 第三章 黃花蒿黃烷酮3-羥化酶(AaF3H)功能鑒定37-41
• 1 材料與方法37-38
• 1.1 材料37
• 1.1.1 酶原料37
• 1.1.2 主要儀器設(shè)備37
• 1.1.3 主要試劑37
• 1.2 方法37-38
• 1.2.1 AaF3H酶促反應(yīng)體系37-38
• 1.2.2 柚皮素及反應(yīng)產(chǎn)物液相檢測38
• 1.2.3 AaF3H酶反應(yīng)的最適pH實驗38
• 1.2.4 AaF3H酶反應(yīng)的最適溫度實驗38
• 1.2.5 AaF3H酶的Km米氏常數(shù)測定38
• 2 結(jié)果與分析38-41
• 2.1 AaF3H酶促反應(yīng)38-39
• 2.2 AaF3H酶反應(yīng)的最適pH39
• 2.3 AaF3H酶反應(yīng)的最適溫度39-40
• 2.4 小結(jié)40
• 2.5 討論40-41
• 第四章 黃花蒿黃酮醇合酶(AaFLS)基因克隆及原核表達(dá)41-47
• 1 材料與方法41-42
• 1.1 材料41
• 1.2 方法41-42
• 1.2.1 AaFLS基因克隆41
• 1.2.2 AaFLS基因原核表達(dá)41
• 1.2.3 AaFLS重組蛋白分離純化及濃縮41-42
• 1.2.4 AaFLS基因的核苷酸和氨基酸序列分析42
• 2 結(jié)果與分析42-47
• 2.1 AaFLS基因的PCR克隆42
• 2.2 AaFLS基因原核表達(dá)42-45
• 2.2.1 AaFLS-T重組質(zhì)粒菌落PCR檢測42-43
• 2.2.2 AaFLS-T重組質(zhì)粒雙酶切43
• 2.2.3 AaFLS-pET28a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α菌落PCR檢測43-44
• 2.2.4 轉(zhuǎn)化了AaFLS-pET28a重組質(zhì)粒的BL21誘導(dǎo)表達(dá)體系SDS-PAGE檢測44-45
• 2.3 AaFLS重組蛋白分離純化及濃縮45
• 2.4 AaFLS基因的核苷酸和氨基酸序列分析45
• 2.5 小結(jié)45-46
• 2.6 討論46-47
• 第五章 黃花蒿黃酮醇合酶(AaFLS)酶的功能驗證47-51
• 1 材料與方法47-48
• 1.1 材料47
• 1.1.1 酶原料47
• 1.1.2 主要儀器設(shè)備47
• 1.1.3 主要試劑47
• 1.2 方法47-48
• 1.2.0 AaFLS酶促反應(yīng)體系底物制備47
• 1.2.1 AaFLS酶促反應(yīng)體系47-48
• 1.2.2 二氫山奈酚及反應(yīng)產(chǎn)物液相檢測48
• 1.2.3 AaFLS酶促反應(yīng)的最適pH實驗48
• 1.2.4 AaFLS酶促反應(yīng)的最適溫度實驗48
• 1.2.5 AaFLS酶的Km米氏常數(shù)測定48
• 2 結(jié)果與分析48-51
• 2.1 AaFLS酶促反應(yīng)48-49
• 2.2 AaFLS酶反應(yīng)的最適pH49
• 2.3 AaFLS酶反應(yīng)的最適溫度49-50
• 2.4 小結(jié)50
• 2.5 討論50-51
• 第六章 研究結(jié)論,創(chuàng)新點及展望51-53
• 6.1 研究結(jié)論51-52
• 6.1.1 從黃花蒿cDNA中克隆了兩個黃酮類化合物生物合成相關(guān)的(AaF3H和AaFLS)基因51
• 6.1.2 以原核表達(dá)方式在大腸桿菌E.Coli BL21(DE3)中表達(dá)了黃酮類化合物生物合成關(guān)鍵酶(AaF3H和AaFLS)并通過酶促活性反應(yīng)對其功能進(jìn)行了鑒定51-52
• 6.2 創(chuàng)新點52
• 6.3 研究展望52-53
• 參考文獻(xiàn)53-63
• 致謝63-64
• 作者簡介64-65

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本文編號：906567