根瘤是豆科植物將空氣中氮?dú)廪D(zhuǎn)化為自身可利用氮的關(guān)鍵器官。根瘤固氮對(duì)提高土壤肥力、增加農(nóng)作物產(chǎn)量以及減少工業(yè)氮肥的使用具有重要意義。固氮根瘤的形成涉及一系列反應(yīng)如根瘤菌早期的侵染和根瘤器官的發(fā)生以及結(jié)瘤過程根發(fā)育的協(xié)調(diào)等,然而豆科植物本身的共生結(jié)瘤機(jī)制尚未完全清楚。半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin,CYS)在結(jié)瘤,根瘤發(fā)育和衰老過程中起重要作用。本研究克隆了2個(gè)大豆半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因GmCYS2和GmCYS20;通過體外蛋白酶活性抑制試驗(yàn)來揭示其生化功能;利用豆科模式植物百脈根作為載體,通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛根轉(zhuǎn)化技術(shù)在百脈根毛根中超量表達(dá)GmCYS2和GmCYS20基因,鑒定復(fù)合體百脈根共生結(jié)瘤表型來證實(shí)GmCYS2和GmCYS20基因在共生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的功能。研究生期間主要研究成果如下:1.克隆了2個(gè)大豆CYS家族基因GmCYS2和GmCYS20,氨基酸序列比對(duì)及進(jìn)化樹分析表明,GmCYS2與木豆(Cajanus cajan)CYS蛋白相似性高達(dá)73%。大豆GmCYS20蛋白與野生大豆(Glycine soja)CYS蛋白相似性高達(dá)99%。2.在大腸桿菌中表達(dá)和純化GmC...

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖3-1大豆GmCYS2與其他豆科植物同源蛋白的多序列比對(duì)

GmCYS2基因全長為393bp,克隆的基因序列與NCBI網(wǎng)站公布的GmCYS2基因序列完全吻合,該基因編碼130個(gè)氨基酸殘基,其中N端是26個(gè)氨基酸殘基編碼的信號(hào)肽組成。通過NCBI網(wǎng)站上的Blastp比對(duì)發(fā)現(xiàn),該基因編碼的蛋白序列與木豆、狹葉羽扇豆、綠豆、赤豆的CYS相....

圖3-2大豆GmCYS20與其他豆科植物同源蛋白的進(jìn)化樹分析

通過DNAMAN軟件得到與上述物種CYS蛋白的進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)大豆GmCYS2蛋白與木豆的CYS蛋白關(guān)系最近,處在同一進(jìn)化分支上且親緣高達(dá)97%(圖3-2)。3.1.2重組蛋白GmCYS2的表達(dá)、純化和體外酶活檢測

圖3-3 His-GST-GmCYS2融合蛋白的序列

構(gòu)建的重組蛋白序列如圖3-3所示,包含雙標(biāo)簽His-GST以及GmCYS2C端的104個(gè)氨基酸,其大小為40kDa左右。氨基酸第5-10位為His標(biāo)簽;14-233位為GST標(biāo)簽;244-250位為煙草蝕紋病毒(TEV)的切割位點(diǎn);251-355位為GmCYS2蛋白序列(去掉....

圖3-4 GmCYS2蛋白的體外表達(dá)、抗體檢測和蛋白純化

圖3-4a,b中1和2泳道分別為兩種條件下的全細(xì)胞裂解液,并且都檢測到了GmCYS蛋白的表達(dá)。用超聲波將全細(xì)胞裂解液破碎然后再離心,SDS-PAGE分析上清液和沉淀,發(fā)現(xiàn)在圖3-4a,b中3和4泳道中,也就是15℃誘導(dǎo)16h條件中目的蛋白條帶集中出現(xiàn)在沉淀中;37℃誘導(dǎo)4h條....

本文編號(hào)：4039068