立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn)屬絲核菌屬(Rhizoctonia),根據(jù)菌絲融合情況被劃分為14個(gè)融合群(anastomosis groups,AGs),即AG-1到AG-13和AG-BI,大多數(shù)類群為植物病原真菌,研究表明其主要致病因子為細(xì)胞壁降解酶和毒素。立枯絲核菌具有寄主范圍廣、危害大特性,每年因立枯絲核菌侵染所引起的水稻紋枯病造成水稻減產(chǎn)嚴(yán)重。目前,水稻種質(zhì)資源中尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)紋枯病完全免疫的抗性材料,也沒(méi)有檢測(cè)到穩(wěn)定的主效數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus,QTL),而且缺乏好的新的抗性基因資源。因此,本研究主要從兩方面著手進(jìn)行研究:對(duì)多個(gè)具有潛在抗真菌病害的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase inhibiting protein,PGIP)基因進(jìn)行克隆及分析,并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化獲得抗紋枯病水稻;對(duì)立枯絲核菌主要致病因子毒素進(jìn)行提純、活性分析及活性成分鑒定,并篩選了毒素降解菌和候選毒素降解酶。主要結(jié)果如下:1.分別從大豆、番茄和甜瓜等植物中克隆到8個(gè)不同PGIP基因:CucmPGIP1、Tri...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 前言
    1 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase inhibiting protein,PGIP)研究進(jìn)展
        1.1 PGIP的結(jié)構(gòu)
        1.2 PGIP的作用機(jī)制
        1.3 PGIP在植物抗病中應(yīng)用
    2 立枯絲核菌毒素研究進(jìn)展
        2.1 立枯絲核菌毒素提取工藝的發(fā)展
        2.2 立枯絲核菌毒素的成分鑒定
            2.2.1 羧酸及衍生物
            2.2.2 糖類及糖胺
        2.3 立枯絲核菌毒素的生物活性檢測(cè)
            2.3.1 粗毒素混合物生物活性檢測(cè)
            2.3.2 單一代謝物生物活性檢測(cè)
        2.4 立枯絲核菌毒素的致病機(jī)理
            2.4.1 毒素對(duì)細(xì)胞破壞作用
            2.4.2 毒素對(duì)細(xì)胞膜的損傷作用
            2.4.3 毒素對(duì)寄主植物酶的影響
    3 本研究的目的和意義
第二章 不同植物PGIP基因克隆及序列測(cè)定
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 菌株和載體
            1.1.3 生化及分子生物學(xué)試劑
            1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器
            1.1.5 試劑及培養(yǎng)基的配制
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 RNA提取
            1.2.2 cDNA合成
            1.2.3 PCR反應(yīng)
            1.2.4 割膠回收
            1.2.5 連T載體
            1.2.6 轉(zhuǎn)大腸桿菌
            1.2.7 挑單克隆驗(yàn)證及測(cè)序
            1.2.8 生物信息學(xué)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 PGIP基因的克隆與序列分析
        2.2 PGIPs生物信息學(xué)分析
    3 結(jié)論與討論
第三章 轉(zhuǎn)PGIP基因水稻獲得及對(duì)紋枯病抗性評(píng)價(jià)
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 菌株和載體
            1.1.3 生化及分子生物學(xué)試劑
            1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器
            1.1.5 試劑及培養(yǎng)基的配制
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 PCR反應(yīng)
            1.2.2 PGIP載體構(gòu)建
            1.2.3 大腸桿菌感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化
            1.2.4 陽(yáng)性克隆鑒定
            1.2.5 質(zhì)粒提取
            1.2.6 基因槍轉(zhuǎn)化水稻
                1.2.6.1 水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)
                1.2.6.2 金粉懸浮液制備
                1.2.6.3 基因槍轟擊愈傷組織
                1.2.6.4 抗性愈傷組織的篩選及分化
                1.2.6.5 無(wú)菌苗的生根及移栽
            1.2.7 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定
                1.2.7.1 轉(zhuǎn)基因植株DNA提取
                1.2.7.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定
            1.2.8 轉(zhuǎn)基因水稻抗紋枯病鑒定
    2 結(jié)果與分析
        2.1 目的基因獲得
        2.2 陽(yáng)性克隆鑒定
        2.3 轉(zhuǎn)基因水稻的獲得與驗(yàn)證
        2.4 轉(zhuǎn)基因水稻抗水稻紋枯病鑒定
    3 結(jié)論與討論
第四章 立枯絲核菌毒素提純、活性分析及活性成分鑒定
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 供試菌株
            1.1.3 培養(yǎng)基與試劑
            1.1.4 PCR引物與測(cè)序
            1.1.5 供試儀器
        1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            1.2.1 立枯絲核菌培養(yǎng)與純化
            1.2.2 立枯絲核菌毒素的制備
            1.2.3 立枯絲核菌毒素組分分離與活性分析
                1.2.3.1 TLC定性分析
                1.2.3.2 毒素活性敏感度分析
                1.2.3.3 HPLC組分分離與活性分析
                1.2.3.4 活性組分LC-MS/MS分析
            1.2.4 毒素生物活性及穩(wěn)定性分析
                1.2.4.1 毒素生物活性分析
                1.2.4.2 毒素穩(wěn)定性分析
            1.2.5 毒素對(duì)不同植株葉片細(xì)胞膜損傷的測(cè)定
            1.2.6 毒素對(duì)不同植株葉片葉綠素含量影響的測(cè)定
            1.2.7 毒素對(duì)水稻根系活力的影響
            1.2.8 毒素對(duì)水稻防御酶的影響
                1.2.8.1 毒素對(duì)水稻PAL的影響
                1.2.8.2 毒素對(duì)水稻PPO的影響
                1.2.8.3 毒素對(duì)水稻POD的影響
    2 結(jié)果與分析
        2.1 毒素的制備
        2.2 立枯絲核菌毒素的組分分析
            2.2.1 TLC定性分析
            2.2.2 毒素活性敏感度分析
            2.2.3 HPLC分離活性組分
            2.2.4 活性組分LC-MS/MS分析
        2.3 胚根伸長(zhǎng)抑制法測(cè)定毒素活性及穩(wěn)定性
            2.3.1 毒素對(duì)水稻胚根伸長(zhǎng)的抑制作用
            2.3.2 溫度、化合物和酶對(duì)毒素活性影響
        2.4 毒素對(duì)不同植株細(xì)胞膜的損傷
        2.5 毒素對(duì)不同植株葉綠素含量的影響
        2.6 毒素對(duì)水稻根系活力的影響
        2.7 毒素對(duì)水稻防御酶的影響
    3 結(jié)論與討論
第五章 降解毒素微生物的篩選及胞外蛋白分析
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 供試菌株和載體
            1.1.3 培養(yǎng)基與試劑
            1.1.4 引物與測(cè)序
            1.1.5 供試儀器
        1.2 方法
            1.2.1 毒素降解菌的篩選鑒定
            1.2.2 降解菌的抑菌活性
            1.2.3 胞外蛋白獲取及生物活性分析
            1.2.4 胞外蛋白再分離及HPLC分析
            1.2.5 SDS-PAGE和蛋白質(zhì)全譜分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 降解菌篩選鑒定
        2.2 降解菌的抑菌效果
        2.3 降解菌胞外蛋白獲取及生物活性分析
        2.4 降解菌胞外蛋白液再分離及HPLC分析
        2.5 SDS-PAGE和蛋白質(zhì)全譜分析
    3 結(jié)論與討論
第六章 總結(jié)與展望
    1 全文總結(jié)
        1.1 不同植物PGIP基因克隆和序列分析
        1.2 轉(zhuǎn)PGIP基因水稻獲得及對(duì)紋枯病抗性評(píng)價(jià)
        1.3 立枯絲核菌毒素的分析
        1.4 毒素降解微生物篩選及蛋白酶分析
    2 問(wèn)題與展望
參考文獻(xiàn)



本文編號(hào)：3836000