立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kühn)屬絲核菌屬(Rhizoctonia),根據菌絲融合情況被劃分為14個融合群(anastomosis groups,AGs),即AG-1到AG-13和AG-BI,大多數類群為植物病原真菌,研究表明其主要致病因子為細胞壁降解酶和毒素。立枯絲核菌具有寄主范圍廣、危害大特性,每年因立枯絲核菌侵染所引起的水稻紋枯病造成水稻減產嚴重。目前,水稻種質資源中尚未發(fā)現(xiàn)對紋枯病完全免疫的抗性材料,也沒有檢測到穩(wěn)定的主效數量性狀基因座(quantitative trait locus,QTL),而且缺乏好的新的抗性基因資源。因此,本研究主要從兩方面著手進行研究:對多個具有潛在抗真菌病害的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase inhibiting protein,PGIP)基因進行克隆及分析,并通過轉基因技術轉化獲得抗紋枯病水稻;對立枯絲核菌主要致病因子毒素進行提純、活性分析及活性成分鑒定,并篩選了毒素降解菌和候選毒素降解酶。主要結果如下:1.分別從大豆、番茄和甜瓜等植物中克隆到8個不同PGIP基因:CucmPGIP1、Tri...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 前言
    1 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase inhibiting protein,PGIP)研究進展
        1.1 PGIP的結構
        1.2 PGIP的作用機制
        1.3 PGIP在植物抗病中應用
    2 立枯絲核菌毒素研究進展
        2.1 立枯絲核菌毒素提取工藝的發(fā)展
        2.2 立枯絲核菌毒素的成分鑒定
            2.2.1 羧酸及衍生物
            2.2.2 糖類及糖胺
        2.3 立枯絲核菌毒素的生物活性檢測
            2.3.1 粗毒素混合物生物活性檢測
            2.3.2 單一代謝物生物活性檢測
        2.4 立枯絲核菌毒素的致病機理
            2.4.1 毒素對細胞破壞作用
            2.4.2 毒素對細胞膜的損傷作用
            2.4.3 毒素對寄主植物酶的影響
    3 本研究的目的和意義
第二章 不同植物PGIP基因克隆及序列測定
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 菌株和載體
            1.1.3 生化及分子生物學試劑
            1.1.4 主要實驗儀器
            1.1.5 試劑及培養(yǎng)基的配制
        1.2 實驗方法
            1.2.1 RNA提取
            1.2.2 cDNA合成
            1.2.3 PCR反應
            1.2.4 割膠回收
            1.2.5 連T載體
            1.2.6 轉大腸桿菌
            1.2.7 挑單克隆驗證及測序
            1.2.8 生物信息學分析
    2 結果與分析
        2.1 PGIP基因的克隆與序列分析
        2.2 PGIPs生物信息學分析
    3 結論與討論
第三章 轉PGIP基因水稻獲得及對紋枯病抗性評價
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 菌株和載體
            1.1.3 生化及分子生物學試劑
            1.1.4 主要實驗儀器
            1.1.5 試劑及培養(yǎng)基的配制
        1.2 實驗方法
            1.2.1 PCR反應
            1.2.2 PGIP載體構建
            1.2.3 大腸桿菌感受態(tài)制備及轉化
            1.2.4 陽性克隆鑒定
            1.2.5 質粒提取
            1.2.6 基因槍轉化水稻
                1.2.6.1 水稻成熟胚愈傷組織的誘導
                1.2.6.2 金粉懸浮液制備
                1.2.6.3 基因槍轟擊愈傷組織
                1.2.6.4 抗性愈傷組織的篩選及分化
                1.2.6.5 無菌苗的生根及移栽
            1.2.7 轉基因植株PCR鑒定
                1.2.7.1 轉基因植株DNA提取
                1.2.7.2 轉基因植株的PCR鑒定
            1.2.8 轉基因水稻抗紋枯病鑒定
    2 結果與分析
        2.1 目的基因獲得
        2.2 陽性克隆鑒定
        2.3 轉基因水稻的獲得與驗證
        2.4 轉基因水稻抗水稻紋枯病鑒定
    3 結論與討論
第四章 立枯絲核菌毒素提純、活性分析及活性成分鑒定
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 供試菌株
            1.1.3 培養(yǎng)基與試劑
            1.1.4 PCR引物與測序
            1.1.5 供試儀器
        1.2 實驗方法
            1.2.1 立枯絲核菌培養(yǎng)與純化
            1.2.2 立枯絲核菌毒素的制備
            1.2.3 立枯絲核菌毒素組分分離與活性分析
                1.2.3.1 TLC定性分析
                1.2.3.2 毒素活性敏感度分析
                1.2.3.3 HPLC組分分離與活性分析
                1.2.3.4 活性組分LC-MS/MS分析
            1.2.4 毒素生物活性及穩(wěn)定性分析
                1.2.4.1 毒素生物活性分析
                1.2.4.2 毒素穩(wěn)定性分析
            1.2.5 毒素對不同植株葉片細胞膜損傷的測定
            1.2.6 毒素對不同植株葉片葉綠素含量影響的測定
            1.2.7 毒素對水稻根系活力的影響
            1.2.8 毒素對水稻防御酶的影響
                1.2.8.1 毒素對水稻PAL的影響
                1.2.8.2 毒素對水稻PPO的影響
                1.2.8.3 毒素對水稻POD的影響
    2 結果與分析
        2.1 毒素的制備
        2.2 立枯絲核菌毒素的組分分析
            2.2.1 TLC定性分析
            2.2.2 毒素活性敏感度分析
            2.2.3 HPLC分離活性組分
            2.2.4 活性組分LC-MS/MS分析
        2.3 胚根伸長抑制法測定毒素活性及穩(wěn)定性
            2.3.1 毒素對水稻胚根伸長的抑制作用
            2.3.2 溫度、化合物和酶對毒素活性影響
        2.4 毒素對不同植株細胞膜的損傷
        2.5 毒素對不同植株葉綠素含量的影響
        2.6 毒素對水稻根系活力的影響
        2.7 毒素對水稻防御酶的影響
    3 結論與討論
第五章 降解毒素微生物的篩選及胞外蛋白分析
    1 材料與方法
        1.1 實驗材料
            1.1.1 植物材料
            1.1.2 供試菌株和載體
            1.1.3 培養(yǎng)基與試劑
            1.1.4 引物與測序
            1.1.5 供試儀器
        1.2 方法
            1.2.1 毒素降解菌的篩選鑒定
            1.2.2 降解菌的抑菌活性
            1.2.3 胞外蛋白獲取及生物活性分析
            1.2.4 胞外蛋白再分離及HPLC分析
            1.2.5 SDS-PAGE和蛋白質全譜分析
    2 結果與分析
        2.1 降解菌篩選鑒定
        2.2 降解菌的抑菌效果
        2.3 降解菌胞外蛋白獲取及生物活性分析
        2.4 降解菌胞外蛋白液再分離及HPLC分析
        2.5 SDS-PAGE和蛋白質全譜分析
    3 結論與討論
第六章 總結與展望
    1 全文總結
        1.1 不同植物PGIP基因克隆和序列分析
        1.2 轉PGIP基因水稻獲得及對紋枯病抗性評價
        1.3 立枯絲核菌毒素的分析
        1.4 毒素降解微生物篩選及蛋白酶分析
    2 問題與展望
參考文獻



本文編號：3836000