一株豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及其對仔豬致病性研究
發(fā)布時間：2021-09-05 06:05
豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）引起豬以腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病,可感染各個年齡段豬尤其對哺乳仔豬具有高度致死率,傳播方式主要是糞-口途徑,對養(yǎng)豬業(yè)造成很大危害。因此,分離TGEV可為該病的流行病學、生物學特征以及作為疫苗生產(chǎn)的后備毒株篩選奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究利用TGEV陽性豬糞便及小腸內(nèi)容物在PK-15細胞中進行病毒分離,成功分離一株TGEV。該分離毒在盲傳10代時出現(xiàn)細胞病變,通過對第15代分離毒進行巢式RT-PCR,間接免疫熒光試驗,電鏡觀察的方法成功鑒定。測定病毒TCID50為10-5.25/0.1 mL。為了深入探究該毒株對仔豬的致病性,本試驗對第15代分離毒經(jīng)口服的方式感染未吃母乳的3日齡仔豬進行致病性分析。結(jié)果表明,攻毒組仔豬在感染12 h后陸續(xù)出現(xiàn)腹瀉癥狀;而對照組仔豬未見異常。臨床癥狀評分表明攻毒組仔豬在攻毒36 h與陰性對照組相比差異極顯著...
【文章來源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學黑龍江省
【文章頁數(shù)】：47 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
TGEV基因組結(jié)構(gòu)圖
一株豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及其對仔豬致病性研究12沉淀用適量pH7.0溶液懸浮，磷鎢酸負染電鏡觀察結(jié)果。2.2.6病毒TCID50計算取96孔細胞培養(yǎng)板，使細胞長滿單層進行病毒接種。取編號十個1.5mL離心管，向每支離心管中加入900μL細胞培養(yǎng)液（100%DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，不含有胎牛血清），然后向1號離心管中加入100μL病毒液，將上述病毒液10倍倍比稀釋后接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每一稀釋度接種一縱排，共8孔，每孔100μL。在每孔加入細胞懸液100μL，同時設(shè)正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排。（100μL生長液100μL細胞懸液）。將培養(yǎng)板放置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時觀察并記錄出現(xiàn)CPE的細胞孔數(shù)，在5%CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)3~5d。根據(jù)Reed-Muench法計算第15代病毒的TCID50[95]。2.3試驗結(jié)果2.3.1樣品巢式RT-PCR鑒定結(jié)果為了明確分離樣本是TGEV陽性，將實驗室保存的腹瀉樣品剪碎研磨處理，經(jīng)過RNA提取和反轉(zhuǎn)錄后，進行巢式RT-PCR鑒定，結(jié)果顯示，出現(xiàn)了與預(yù)期長度相符的目的片段。圖2-1腹瀉樣品TGEVN基因巢式RT-PCR擴增結(jié)果Fig2-1TheinducedforTGEVpartialNgenebynestRT-PCRM.DL2000DNAMarker；1，2.外套擴增產(chǎn)物；3，4.內(nèi)套擴增產(chǎn)物；5.陰性對照LaneM.DL2000DNAmarker;Lane1,2.Firstroundpositiveamplificationproducts;Lane3,4.Secondroundpositiveamplificationproducts;Lane5.Negativecontrol2.3.2分離毒CPE觀察將處理后的TGEV陽性病料接種于PK-15細胞培養(yǎng)60h，將細胞凍融三次繼續(xù)接種于PK-15細胞直至出現(xiàn)細胞病變。結(jié)果顯示在盲傳第10代60h首次出現(xiàn)CPE，但CPE不明顯，隨著代次增加CPE出現(xiàn)的時間縮短，當盲傳到第15代48h時，可觀察到PK-15細胞出現(xiàn)明顯的細胞病變。主要表現(xiàn)為細胞圓縮并形成合胞體，部分細胞有脫落現(xiàn)象，其細胞
豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定13病變形態(tài)為典型的TGEV感染細胞病變；而未接毒的細胞無細胞病變現(xiàn)象且細胞狀態(tài)良好。圖2-2TGEV分離株感染PK-15細胞48hCPE觀察Fig2-2Cytopathogeniceffect(CPE)inducedbyTGEVonPK-15cell48hA：未接毒的PK-15細胞；B:TGEV分離毒感染的PK-15細胞A：PK-15cellwithoutinoculatedbyTGEV.B：TheCPEofPK-15cellinducedbyTGEV2.3.3分離毒RT-PCR特異性檢測結(jié)果為了從核酸角度驗證分離毒是TGEV，將第15代分離毒通過巢式RT-PCR鑒定，并用實驗室已建立的方法與PEDV、PDCoV進行共同檢測。結(jié)果顯示，分離毒泳道出現(xiàn)的片段與預(yù)期大小相符。其他豬腸道病毒均為陰性。說明只有TGEV在PK-15細胞中得到了增殖。圖2-3TGEV分離毒病原特異性RT-PCR鑒定結(jié)果Fig2-3RT-PCRspecificityidentificationofTGEVisolationstrainM.DL2000DNAMarker；1.TGEV檢測；2.陰性對照；3.PEDV檢測；4.PDCoV檢測LaneM.DL2000DNAmarker;Lane1.TGEVdetection;Lane2.Negativecontrol;Lane3.PEDVdetection；4.PEDVdetection2.3.4分離毒IFA鑒定結(jié)果通過IFA試驗鑒定分離毒是TGEV，選擇第15代分離毒進行驗證。利用TGEVN蛋白鼠源單克隆抗體作為一抗，正常培養(yǎng)的PK-15細胞為陰性對照。結(jié)果顯示，接毒組出現(xiàn)明顯綠色熒光信號，而對照組未見熒光信號。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]2018年廣西重要豬源病毒性疫病流行病學調(diào)查[J]. 施開創(chuàng),尹彥文,王孝德,謝守玉,石永勝,劉宏梅,陸文俊,屈素潔,馮淑萍,粟艷瓊. 中國畜牧獸醫(yī). 2020(01)
[2]豬傳染性胃腸炎病毒SY株的分離鑒定及S基因的序列分析[J]. 尤劉陽,蘇丹萍,宋亞兵,王飛,陳小芬,賀東生. 中國獸醫(yī)科學. 2016(05)
[3]豬腹瀉相關(guān)病毒多重RT-PCR檢測方法的建立[J]. 吳洋,杜彩虹,張博,唐麗杰,喬薪瑗,姜艷平,李一經(jīng). 中國預(yù)防獸醫(yī)學報. 2014(05)
[4]豬傳染性胃腸炎病毒江蘇株的分離與鑒定及其S基因序列分析[J]. 郭容利,倪艷秀,溫立斌,李彬,王小敏,俞正玉,何孔旺. 華北農(nóng)學報. 2013(05)
[5]豬傳染性胃腸炎病毒LJ-12株的分離與鑒定[J]. 姜春霞,馬廣鵬,姜艷平,崔文,李海濱,唐麗杰,葛俊偉,喬薪瑗,李一經(jīng). 畜牧與獸醫(yī). 2013(03)
[6]豬傳染性胃腸炎病毒福建株M基因的克隆與生物信息學分析[J]. 朱曉琳,王劭,陳少鶯,林鋒強,程曉霞,陳仕龍,朱小麗,李兆龍. 福建農(nóng)業(yè)學報. 2011(06)
[7]豬流行性腹瀉病毒N基因的克隆及原核表達[J]. 楊巍,李廣興,孟凡丹,王鑫,任曉峰. 東北農(nóng)業(yè)大學學報. 2011(06)
[8]套式PCR與血清學方法用于檢測肺炎支原體感染的對比研究[J]. 劉雪梅,唐正宇,謝良依. 當代醫(yī)學. 2011(18)
[9]一例豬傳染性胃腸炎的診斷及預(yù)防[J]. 張蕾. 湖南畜牧獸醫(yī). 2010(06)
[10]豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬A群輪狀病毒多重RT-PCR檢測方法的建立及臨床應(yīng)用[J]. 張坤,何啟蓋. 畜牧獸醫(yī)學報. 2010(08)
博士論文
[1]豬流行性腹瀉病毒感染性cDNA克隆的構(gòu)建及S基因突變對弱毒株體外增殖和致病性的影響[D]. 李劼.中國農(nóng)業(yè)大學 2017
[2]豬傳染性胃腸炎病毒感染ST細胞差異蛋白質(zhì)組學研究[D]. 馬瑞麗.西北農(nóng)林科技大學 2015
[3]豬傳染性胃腸炎病毒強弱毒株與豬空腸上皮細胞和豬樹突狀細胞相互作用的研究[D]. 趙珊珊.南京農(nóng)業(yè)大學 2014
碩士論文
[1]豬傳染性胃腸炎流行毒株的分離鑒定及全基因組分析[D]. 朱蘊暖.黑龍江八一農(nóng)墾大學 2017
[2]豬傳染性胃腸炎病毒分離及部分特性鑒定[D]. 徐靜.東北農(nóng)業(yè)大學 2015
[3]傳染性胰腺壞死病毒VP2抗原表位區(qū)間接免疫熒光方法的建立[D]. 王健楠.東北農(nóng)業(yè)大學 2012
[4]豬傳染性胃腸炎病毒TaqMan熒光定量RT-PCR方法的建立及初步應(yīng)用[D]. 肖文.華中農(nóng)業(yè)大學 2011
[5]豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉二聯(lián)核酸疫苗免疫效力研究[D]. 孟凡丹.東北農(nóng)業(yè)大學 2011
[6]豬細小病毒VP2蛋白單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA方法的初步建立[D]. 劉秀芬.東北農(nóng)業(yè)大學 2009
[7]豬傳染性胃腸炎病毒SC-H株重組N蛋白單克隆抗體的制備[D]. 李娜.四川農(nóng)業(yè)大學 2008
[8]豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒的分離、鑒定及部分基因序列分析[D]. 劉礦.河南農(nóng)業(yè)大學 2008
[9]豬傳染性胃腸炎病毒膠體金免疫層析試紙條的研制[D]. 暢丹.東北農(nóng)業(yè)大學 2008
本文編號：3384825
【文章來源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學黑龍江省
【文章頁數(shù)】：47 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
TGEV基因組結(jié)構(gòu)圖
一株豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及其對仔豬致病性研究12沉淀用適量pH7.0溶液懸浮，磷鎢酸負染電鏡觀察結(jié)果。2.2.6病毒TCID50計算取96孔細胞培養(yǎng)板，使細胞長滿單層進行病毒接種。取編號十個1.5mL離心管，向每支離心管中加入900μL細胞培養(yǎng)液（100%DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，不含有胎牛血清），然后向1號離心管中加入100μL病毒液，將上述病毒液10倍倍比稀釋后接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每一稀釋度接種一縱排，共8孔，每孔100μL。在每孔加入細胞懸液100μL，同時設(shè)正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排。（100μL生長液100μL細胞懸液）。將培養(yǎng)板放置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時觀察并記錄出現(xiàn)CPE的細胞孔數(shù)，在5%CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)3~5d。根據(jù)Reed-Muench法計算第15代病毒的TCID50[95]。2.3試驗結(jié)果2.3.1樣品巢式RT-PCR鑒定結(jié)果為了明確分離樣本是TGEV陽性，將實驗室保存的腹瀉樣品剪碎研磨處理，經(jīng)過RNA提取和反轉(zhuǎn)錄后，進行巢式RT-PCR鑒定，結(jié)果顯示，出現(xiàn)了與預(yù)期長度相符的目的片段。圖2-1腹瀉樣品TGEVN基因巢式RT-PCR擴增結(jié)果Fig2-1TheinducedforTGEVpartialNgenebynestRT-PCRM.DL2000DNAMarker；1，2.外套擴增產(chǎn)物；3，4.內(nèi)套擴增產(chǎn)物；5.陰性對照LaneM.DL2000DNAmarker;Lane1,2.Firstroundpositiveamplificationproducts;Lane3,4.Secondroundpositiveamplificationproducts;Lane5.Negativecontrol2.3.2分離毒CPE觀察將處理后的TGEV陽性病料接種于PK-15細胞培養(yǎng)60h，將細胞凍融三次繼續(xù)接種于PK-15細胞直至出現(xiàn)細胞病變。結(jié)果顯示在盲傳第10代60h首次出現(xiàn)CPE，但CPE不明顯，隨著代次增加CPE出現(xiàn)的時間縮短，當盲傳到第15代48h時，可觀察到PK-15細胞出現(xiàn)明顯的細胞病變。主要表現(xiàn)為細胞圓縮并形成合胞體，部分細胞有脫落現(xiàn)象，其細胞
豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定13病變形態(tài)為典型的TGEV感染細胞病變；而未接毒的細胞無細胞病變現(xiàn)象且細胞狀態(tài)良好。圖2-2TGEV分離株感染PK-15細胞48hCPE觀察Fig2-2Cytopathogeniceffect(CPE)inducedbyTGEVonPK-15cell48hA：未接毒的PK-15細胞；B:TGEV分離毒感染的PK-15細胞A：PK-15cellwithoutinoculatedbyTGEV.B：TheCPEofPK-15cellinducedbyTGEV2.3.3分離毒RT-PCR特異性檢測結(jié)果為了從核酸角度驗證分離毒是TGEV，將第15代分離毒通過巢式RT-PCR鑒定，并用實驗室已建立的方法與PEDV、PDCoV進行共同檢測。結(jié)果顯示，分離毒泳道出現(xiàn)的片段與預(yù)期大小相符。其他豬腸道病毒均為陰性。說明只有TGEV在PK-15細胞中得到了增殖。圖2-3TGEV分離毒病原特異性RT-PCR鑒定結(jié)果Fig2-3RT-PCRspecificityidentificationofTGEVisolationstrainM.DL2000DNAMarker；1.TGEV檢測；2.陰性對照；3.PEDV檢測；4.PDCoV檢測LaneM.DL2000DNAmarker;Lane1.TGEVdetection;Lane2.Negativecontrol;Lane3.PEDVdetection；4.PEDVdetection2.3.4分離毒IFA鑒定結(jié)果通過IFA試驗鑒定分離毒是TGEV，選擇第15代分離毒進行驗證。利用TGEVN蛋白鼠源單克隆抗體作為一抗，正常培養(yǎng)的PK-15細胞為陰性對照。結(jié)果顯示，接毒組出現(xiàn)明顯綠色熒光信號，而對照組未見熒光信號。
【參考文獻】：
期刊論文
[1]2018年廣西重要豬源病毒性疫病流行病學調(diào)查[J]. 施開創(chuàng),尹彥文,王孝德,謝守玉,石永勝,劉宏梅,陸文俊,屈素潔,馮淑萍,粟艷瓊. 中國畜牧獸醫(yī). 2020(01)
[2]豬傳染性胃腸炎病毒SY株的分離鑒定及S基因的序列分析[J]. 尤劉陽,蘇丹萍,宋亞兵,王飛,陳小芬,賀東生. 中國獸醫(yī)科學. 2016(05)
[3]豬腹瀉相關(guān)病毒多重RT-PCR檢測方法的建立[J]. 吳洋,杜彩虹,張博,唐麗杰,喬薪瑗,姜艷平,李一經(jīng). 中國預(yù)防獸醫(yī)學報. 2014(05)
[4]豬傳染性胃腸炎病毒江蘇株的分離與鑒定及其S基因序列分析[J]. 郭容利,倪艷秀,溫立斌,李彬,王小敏,俞正玉,何孔旺. 華北農(nóng)學報. 2013(05)
[5]豬傳染性胃腸炎病毒LJ-12株的分離與鑒定[J]. 姜春霞,馬廣鵬,姜艷平,崔文,李海濱,唐麗杰,葛俊偉,喬薪瑗,李一經(jīng). 畜牧與獸醫(yī). 2013(03)
[6]豬傳染性胃腸炎病毒福建株M基因的克隆與生物信息學分析[J]. 朱曉琳,王劭,陳少鶯,林鋒強,程曉霞,陳仕龍,朱小麗,李兆龍. 福建農(nóng)業(yè)學報. 2011(06)
[7]豬流行性腹瀉病毒N基因的克隆及原核表達[J]. 楊巍,李廣興,孟凡丹,王鑫,任曉峰. 東北農(nóng)業(yè)大學學報. 2011(06)
[8]套式PCR與血清學方法用于檢測肺炎支原體感染的對比研究[J]. 劉雪梅,唐正宇,謝良依. 當代醫(yī)學. 2011(18)
[9]一例豬傳染性胃腸炎的診斷及預(yù)防[J]. 張蕾. 湖南畜牧獸醫(yī). 2010(06)
[10]豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬A群輪狀病毒多重RT-PCR檢測方法的建立及臨床應(yīng)用[J]. 張坤,何啟蓋. 畜牧獸醫(yī)學報. 2010(08)
博士論文
[1]豬流行性腹瀉病毒感染性cDNA克隆的構(gòu)建及S基因突變對弱毒株體外增殖和致病性的影響[D]. 李劼.中國農(nóng)業(yè)大學 2017
[2]豬傳染性胃腸炎病毒感染ST細胞差異蛋白質(zhì)組學研究[D]. 馬瑞麗.西北農(nóng)林科技大學 2015
[3]豬傳染性胃腸炎病毒強弱毒株與豬空腸上皮細胞和豬樹突狀細胞相互作用的研究[D]. 趙珊珊.南京農(nóng)業(yè)大學 2014
碩士論文
[1]豬傳染性胃腸炎流行毒株的分離鑒定及全基因組分析[D]. 朱蘊暖.黑龍江八一農(nóng)墾大學 2017
[2]豬傳染性胃腸炎病毒分離及部分特性鑒定[D]. 徐靜.東北農(nóng)業(yè)大學 2015
[3]傳染性胰腺壞死病毒VP2抗原表位區(qū)間接免疫熒光方法的建立[D]. 王健楠.東北農(nóng)業(yè)大學 2012
[4]豬傳染性胃腸炎病毒TaqMan熒光定量RT-PCR方法的建立及初步應(yīng)用[D]. 肖文.華中農(nóng)業(yè)大學 2011
[5]豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉二聯(lián)核酸疫苗免疫效力研究[D]. 孟凡丹.東北農(nóng)業(yè)大學 2011
[6]豬細小病毒VP2蛋白單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA方法的初步建立[D]. 劉秀芬.東北農(nóng)業(yè)大學 2009
[7]豬傳染性胃腸炎病毒SC-H株重組N蛋白單克隆抗體的制備[D]. 李娜.四川農(nóng)業(yè)大學 2008
[8]豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒的分離、鑒定及部分基因序列分析[D]. 劉礦.河南農(nóng)業(yè)大學 2008
[9]豬傳染性胃腸炎病毒膠體金免疫層析試紙條的研制[D]. 暢丹.東北農(nóng)業(yè)大學 2008
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