CRISPR/Cas9技術(shù)是一種新型的基因組靶向修飾技術(shù),可以對生物體基因組特異位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)改造。能夠高效的在靶位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈缺口（Double-strand breaks,DSB）。通過有錯誤傾向的非同源末端連接（Non-homologous end joining,NHEJ）機(jī)制修復(fù),從而引入插入缺失突變。肌肉生長抑制素（Myostatin,MSTN）是一類能夠在骨骼肌中特異表達(dá),并對骨骼肌的生長起到負(fù)調(diào)控作用的糖蛋白,又被稱為生長分化因子-8（Growth differentiation factor-8,GDF-8）,屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）超家族。MSTN基因的缺失或突變可引起動物出現(xiàn)“雙肌”性狀,促進(jìn)動物肌肉的生長,提高產(chǎn)肉性能。利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備MSTN基因敲除的綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞,為制備MSTN基因敲除綿羊個體提供了材料。試驗設(shè)計了4組特異靶向綿羊MSTN基因的靶位點(diǎn),通過酶切連接的方法插入到CRISPR/Cas9骨架載體中并對其測序驗證。通過酶消化法,分離培養(yǎng)了綿羊肌肉衛(wèi)星細(xì)胞,在形態(tài)... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究歷程
    1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與分類
    1.3 CRISPR/Cas9的作用機(jī)理
    1.4 CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)選擇及相關(guān)工具
    1.5 CRISPR/Cas9的應(yīng)用
        1.5.1 在基因功能研究中的應(yīng)用
        1.5.2 在模式生物構(gòu)建中的應(yīng)用
        1.5.3 在新品種改造和培育中的應(yīng)用
        1.5.4 在基因治療中的應(yīng)用
    1.6 CRISPR/Cas9與ZFN和TALEN比較
    1.7 CRISPR/Cas9技術(shù)存在的問題
    1.8 研究展望
    1.9 本研究的立題依據(jù)及研究內(nèi)容
第二章 CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建與鑒定
    2.1 引言
    2.2 材料
        2.2.1 主要試驗材料
        2.2.2 主要試驗試劑
        2.2.3 主要試驗儀器設(shè)備
        2.2.4 主要試驗試劑的配制
    2.3 試驗方法
        2.3.1 MSTN靶位點(diǎn)設(shè)計與合成
        2.3.2 退火
        2.3.3 pX330質(zhì)粒的酶切
        2.3.4 DNA膠回收
        2.3.5 載體連接
        2.3.6 pX330-target載體轉(zhuǎn)化
        2.3.7 陽性菌落的挑取與培養(yǎng)
        2.3.8 質(zhì)粒少量提取
        2.3.9 質(zhì)粒的鑒定
        2.3.10 質(zhì)粒大量提取
        2.3.11 質(zhì)粒濃度的測定
    2.4 試驗結(jié)果與分析
        2.4.1 MSTN靶位點(diǎn)設(shè)計與合成
        2.4.2 質(zhì)粒的鑒定
        2.4.3 質(zhì)粒濃度的測定
    2.5 討論
第三章 綿羊原代肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
    3.1 引言
    3.2 材料
        3.2.1 主要試驗材料
        3.2.2 主要試驗試劑
        3.2.3 主要試驗儀器設(shè)備
        3.2.4 主要試驗試劑的配制
    3.3 試驗方法
        3.3.1 肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離純化
        3.3.2 肌衛(wèi)星細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
        3.3.3 肌衛(wèi)星細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
        3.3.4 肌衛(wèi)星細(xì)胞生長曲線的繪制
        3.3.5 肌衛(wèi)星細(xì)胞的誘導(dǎo)分化與HE細(xì)胞染色
        3.3.6 肌衛(wèi)星細(xì)胞總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄
        3.3.7 肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定
    3.4 試驗結(jié)果與分析
        3.4.1 肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)
        3.4.2 肌衛(wèi)星細(xì)胞生長曲線的繪制與分析
        3.4.3 肌衛(wèi)星細(xì)胞的肌管誘導(dǎo)
        3.4.4 肌衛(wèi)星細(xì)胞總RNA的提取
        3.4.5 肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定
    3.5 討論
第四章 CRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)染肌衛(wèi)星細(xì)胞及序列分析
    4.1 引言
    4.2 材料
        4.2.1 主要試驗材料
        4.2.2 主要試驗試劑
        4.2.3 主要試驗儀器設(shè)備
        4.2.4 主要試驗試劑的配制
    4.3 試驗方法
        4.3.1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
        4.3.2 綿羊肌衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        4.3.3 CRISPR/Cas9打靶載體的活性檢測
        4.3.4 SURVEYOR檢測靶位點(diǎn)突變率
        4.3.5 極限稀釋法制備單細(xì)胞克隆
        4.3.6 MSTN基因突變細(xì)胞系的篩選和類型分析
    4.4 試驗結(jié)果與分析
        4.4.1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
        4.4.2 CRISPR/Cas9打靶載體的活性檢測
        4.4.3 SURVEYOR檢測靶位點(diǎn)突變率
        4.4.4 單細(xì)胞克隆的制備及MSTN基因突變細(xì)胞系的篩選
    4.5 討論
第五章 全文結(jié)論
    5.1 主要結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    5.3 后期計劃
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷



本文編號：3072270