銅綠假單胞菌能引起林麝的化膿病,該病病程緩慢、不易發(fā)現(xiàn),發(fā)現(xiàn)后也難以治愈,給人工養(yǎng)殖林麝造成巨大損失。本試驗旨在建立一種特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高的間接ELISA方法,為監(jiān)測林麝體內(nèi)的銅綠假單胞菌抗體水平,并為防控銅綠假單胞菌引起的林麝化膿性疾病提供幫助和指導(dǎo)。提取銅綠假單胞菌Sp-1株的外膜蛋白作為包被抗原。經(jīng)SDS-PAGE分析,提取的外膜蛋白有7-10條帶,分子量在15kDa～100kDa之間,是該菌的主要外膜蛋白。通過Western Blotting檢測,發(fā)現(xiàn)該外膜蛋白有4條印跡條帶,分子量分別是46 kDa、34kDa、25 kDa和19 kDa,可用作包被抗原。本試驗建立的間接ELISA方法的最佳條件：外膜蛋白包被濃度為1.5 μg/ml;包被條件是37℃,溫箱孵育4h；封閉條件為5%脫脂奶粉37℃作用2h；抗體稀釋倍數(shù)為1000倍,抗體與抗原作用條件為37℃孵育1.5 h；HRP-SPA稀釋倍數(shù)為64000倍,與抗體作用條件為37℃孵育1.5 h; TMB作用條件為37℃顯色15 min。用建立的間接ELISA方法檢測了大腸桿菌抗血清、沙門氏菌抗血清、不動桿菌抗血清和金黃色葡萄球菌抗血清,結(jié)果這四種菌的抗血清均判為銅綠假單胞菌抗體陰性；把Sp-1株陽性血清用外膜蛋白處理后進(jìn)行檢測,結(jié)果表明,與未處理組相比,處理組OD值顯著降低,阻斷率在63.69%～75.38%之間。經(jīng)板間重復(fù)試驗和板內(nèi)重復(fù)試驗進(jìn)行重復(fù)性檢測,變異系數(shù)在2%～10%之間。將本試驗制備的銅綠假單胞菌Sp-1株陽性血清倍比稀釋后進(jìn)行檢測,當(dāng)稀釋至32000倍時,其P/N值2,結(jié)果仍判為陽性。用該方法檢測了30份經(jīng)Sp-1株免疫后的小鼠血清,效價達(dá)到1：12500、1：2500、1：500和1：100的分別有13份、7份、2份和2份,低于1：100的有6份。同時,檢測了2014年10月份和11月份采集的林麝血清樣品32份,有4份血清判為陽性,其余判為陰性。本試驗建立的檢測林麝銅綠假單胞菌抗體的間接ELISA方法具有重復(fù)性好、特異性強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn),可用于林麝群體的抗體水平的監(jiān)測,能夠為制定合理的免疫程序提供理論依據(jù)和防控銅綠假單胞菌引起化膿性性疾病提供幫助和指導(dǎo)。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：S858.94
【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 銅綠假單胞菌概述
        1.1.1 銅綠假單胞菌的病原學(xué)
        1.1.2 銅綠假單胞菌的危害
        1.1.3 外毒素A
        1.1.4 銅綠假單胞菌的外膜蛋白
        1.1.5 銅綠假單胞菌的分型
        1.1.6 銅綠假單胞菌的耐藥性
    1.2 我國林麝養(yǎng)殖現(xiàn)狀
    1.3 診斷方法
        1.3.1 細(xì)菌學(xué)檢驗
        1.3.2 分子學(xué)診斷
        1.3.3 血清學(xué)診斷
    1.4 銅綠假單胞菌病的防治
        1.4.1 預(yù)防
        1.4.2 治療
    1.5 ELISA研究進(jìn)展
    1.6 研究目的和意義
2 試驗材料
    2.1 試驗菌株與試驗動物
    2.2 主要試劑
    2.3 主要儀器
    2.4 主要溶液及配制
        2.4.1 培養(yǎng)基等
        2.4.2 SDS-PAGE及Western Blotting涉及溶液
        2.4.3 ELISA涉及溶液
3 試驗方法
    3.1 包被抗原和抗Sp-1株全菌血清
        3.1.1 包被抗原的制備
        3.1.2 抗Sp-1株全菌血清的制備
        3.1.3 林麝陰性血清的制備
    3.2 間接ELISA方法的建立
        3.2.1 間接ELSIA條件的優(yōu)化
        3.2.2 特異性試驗
        3.2.3 重復(fù)性試驗
        3.2.4 靈敏度試驗
        3.2.5 包被板保存期試驗
    3.3 臨床樣品檢測
        3.3.1 免疫后小鼠血清中銅綠假單胞菌抗體水平的檢測
        3.3.2 林麝血清中銅綠假單胞菌抗體水平的檢測
4 試驗結(jié)果
    4.1 外膜蛋白與抗血清的制備與檢測
        4.1.1 外膜蛋白濃度測定
        4.1.2 外膜蛋白SDS-PAGE電泳及Western Blotting結(jié)果
        4.1.3 抗血清雙向瓊擴(kuò)檢測結(jié)果
    4.2 間接ELISA方法的建立
        4.2.1 間接ELISA條件的優(yōu)化
        4.2.2 特異性試驗
        4.2.3 重復(fù)性試驗
        4.2.4 靈敏度試驗
        4.2.5 保存期試驗
    4.3 臨床樣品檢測
        4.3.1 免疫后小鼠血清中銅綠假單胞菌抗體水平的檢測
        4.3.2 林麝血清中銅綠假單胞菌抗體的檢測
5 討論
    5.1 包被抗原和抗血清
        5.1.1 包被抗原的選擇
        5.1.2 外膜蛋白的制備方法
        5.1.3 外膜蛋白
        5.1.4 免疫程序及抗血清的制備
    5.2 ELISA條件的選擇
        5.2.1 酶標(biāo)儀測定方法的選擇
        5.2.2 外膜蛋白最佳包被濃度和血清最佳稀釋度
        5.2.3 其它條件的選擇
        5.2.4 保存期
    5.3 臨床檢測結(jié)果分析
6 結(jié)論
7 本論文的創(chuàng)新之處
參考文獻(xiàn)
致謝

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本文編號：2846725