鴿源禽毛滴蟲又稱鴿毛滴蟲,屬鞭毛蟲綱、毛滴蟲科、毛滴蟲屬,其嗜好寄生部位是鴿消化道前段,引起各種消化道癥狀,導(dǎo)致鴿毛滴蟲病,本病沒有季節(jié)性,宿主對本病的敏感性沒有品種和日齡的差別,其中幼鴿對本病最為敏感,成年鴿抵抗力強,常呈無癥狀的隱性感染。蟲體寄生于粘膜上皮細胞間隙處,發(fā)病時表現(xiàn)為一層壞死性潰瘍覆蓋于口腔、食道、嗉囊、胃部粘膜之上,癥狀嚴重時粘膜外覆蓋黃色粗糙的干酪樣滲出物,導(dǎo)致患鴿呼吸和采食困難,口腔分泌物增多,眼觀癥狀比較直觀的是胸部羽毛臟亂,癥狀進一步發(fā)展會造成宿主死亡。目前治療本病常采用化學(xué)藥物,藥物對動物容易產(chǎn)生副作用,且抗藥蟲株很容易被藥物的選擇壓力下誘導(dǎo)產(chǎn)生。有必要深入了解疫苗相關(guān)蛋白分子,開發(fā)安全有效的防治方法。G3蛋白有多個開放閱讀框,具有良好的免疫原性,本研究將新型蛋白進行克隆表達,鑒定其免疫原性,評估其開發(fā)新型疫苗的可能性,為防控鴿毛滴蟲病提供新途徑。主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下:1.鴿源禽毛滴蟲G3(TgG3)蛋白的克隆及測序根據(jù)已上傳的陰道毛滴蟲G3(TvG3)蛋白部分基因序列ORF設(shè)計引物,提取鴿源禽毛滴蟲總RNA,反轉(zhuǎn)錄,經(jīng)PCR擴增獲得TgG3蛋白基因序列。經(jīng)TA克隆至pJET 1.2克隆質(zhì)粒里,經(jīng)生工測序,TgG3蛋白的ORF包含堿基序列1623bp,編碼540個氨基酸,蛋白質(zhì)理論分子量為63.7千道爾頓。2.鴿源禽毛滴蟲G3(TgG3)蛋白的序列及生物信息學(xué)分析比對鴿源禽毛滴蟲G3(TgG3)蛋白與陰道毛滴蟲G3(TvG3)蛋白的堿基序列,兩者堿基同源性為78%,從5’端到3’端差異均勻分布,每隔幾個堿基就有差異出現(xiàn),未檢索到TgG3堿基序列與其他蛋白有很大同源性。經(jīng)氨基酸序列比對,鴿源禽毛滴蟲G3(TgG3)蛋白與陰道毛滴蟲G3(TvG3)蛋白氨基酸同源性達98%,氨基酸序列有9處不同。該蛋白與胎兒三毛滴蟲TRFO_13881蛋白氨基酸同源性達83%。使用生物信息學(xué)軟件對鴿源禽毛滴蟲G3(TgG3)蛋白氨基酸序列進行分析預(yù)測,顯示TgG3蛋白無前導(dǎo)肽和信號肽、有親水性、為堿性氨基酸、無GPI,有SMC結(jié)構(gòu)域。3.鴿源禽毛滴蟲G3重組蛋白多克隆抗體的制備采用同源重組法,用CloneEZ PCR克隆試劑盒構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-G3,將重組陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli transetta中,IPTG誘導(dǎo)表達,將菌體超聲破碎,取包涵體用尿素溶解、經(jīng)Ni柱純化。SDS-PAGE電泳顯示,原核表達的重組蛋白大小約為63.7KDa,與軟件預(yù)計的分子量大小相符。將純化后的原核表達鴿源禽毛滴蟲G3蛋白加佐劑免疫小鼠,制備多克隆抗體高免血清,用間接ELISA法檢測血清抗體效價。采用Westerm-blot鑒定分析G3重組蛋白的抗原性,制備的小鼠多抗能夠識別pET28a-G3原核表達的重組蛋白,原核表達的重組蛋白具有良好的抗原性。4.多抗與蟲體天然蛋白反應(yīng)性檢測取對數(shù)生長期的蟲體裂解經(jīng)蛋白質(zhì)電泳,用抗G3蛋白小鼠多抗進行Western-blot,結(jié)果顯示,鴿源禽毛滴蟲蟲體中有分子量為63kDa左右的蛋白能夠被抗G3蛋白小鼠多抗識別,說明原核表達的G3重組蛋白有良好的免疫原性。本試驗經(jīng)PCR擴增獲得鴿源禽毛滴蟲G3蛋白堿基序列,構(gòu)建了原核表達重組質(zhì)粒pET28a-G3并用transetta表達出分子量為63.7kDa的重組蛋白,免疫小鼠制備的多抗能夠識別原核表達的重組蛋白,說明重組蛋白抗原性良好。多抗與蟲體蛋白反應(yīng)性良好,說明重組蛋白的免疫原性良好。
【學(xué)位單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S858.39

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 蘇周;;鴿副粘病毒病和毛滴蟲病混合感染的診治報告[J];家禽科學(xué);2016年08期

2 孫靜靜;姜夕s

本文編號：2821480