發(fā)布時(shí)間：2020-08-26 12:14

【摘要】：1.H_2O_2誘導(dǎo)斜帶石斑魚肝細(xì)胞氧化損傷模型的建立通過(guò)不同的過(guò)氧化氫培養(yǎng)濃度(0、100、200、400、600、800、1000μmol/L)和作用時(shí)間(2、4、6、8、12、24 h)探索適宜的斜帶石斑魚肝細(xì)胞氧化損傷濃度和時(shí)間,以建立的斜帶石斑魚原代肝細(xì)胞氧化損傷模型,并檢測(cè)培養(yǎng)過(guò)程中肝細(xì)胞的數(shù)量和活性的變化。采用單因子完全隨機(jī)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),根據(jù)臺(tái)盼藍(lán)對(duì)死細(xì)胞拒染法利用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定細(xì)胞活力及數(shù)量,并通過(guò)MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示,800μmol/L H_2O_2,作用8 h,斜帶石斑魚肝細(xì)胞的存活率降低至61.98%。2.H_2O_2對(duì)斜帶石斑魚原代肝細(xì)胞活性及功能的影響本研究采用斜帶石斑魚原代肝細(xì)胞模型,主要探究過(guò)氧化氫對(duì)原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞氧化損傷機(jī)制的影響。通過(guò)測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間下過(guò)氧化氫不同作用濃度的肝細(xì)胞或培養(yǎng)上清液中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、脂質(zhì)過(guò)氧化物(LPO)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)、過(guò)氧化氫酶(CAT)的變化,分析細(xì)胞生長(zhǎng)代謝狀態(tài)。結(jié)果顯示,使用過(guò)氧化氫處理后其他各組與800μmol/L和1000μmol/L組相比顯著降低了CAT、GSH-PX和SOD活性,顯著升高LPO、MDA含量(P0.05),但是800和1000μmol/L組之間沒(méi)有顯著差異(P0.05)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):H_2O_2過(guò)氧化氫作用時(shí)間為8 h、作用濃度為800μmol/L,使斜帶石斑魚原代肝細(xì)胞產(chǎn)生了明顯的氧化應(yīng)激,該條件可作為建立斜帶石斑魚肝細(xì)胞氧化損傷模型的適宜條件。3.利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究過(guò)氧化氫對(duì)肝細(xì)胞差異表達(dá)影響本研究以過(guò)氧化氫為刺激源誘導(dǎo)建立了斜帶石斑魚肝細(xì)胞氧化損傷模型,試驗(yàn)基于RNA-Seq技術(shù)對(duì)正常處理組(L-15)和對(duì)照組(800μmol/L H_2O_2)的斜帶石斑魚肝細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序,利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)深度分析細(xì)胞內(nèi)部基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及過(guò)氧化氫處理后細(xì)胞表型和功能的改變。結(jié)果顯示,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),對(duì)83,802,103條原始reads的篩選和排除,拼接獲得到了112,618條Unigenes,平均長(zhǎng)度為957.45 bp,N50為1,687 bp。按照Blast等相關(guān)軟件,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)分析后,共得到功能注釋基因110,560個(gè)。依據(jù)GO富集分析發(fā)現(xiàn),差異表達(dá)基因主要被集中在代謝通路、細(xì)胞過(guò)程、生物調(diào)控等通路中,在KEGG pathway富集分析中結(jié)果顯示,代謝通路涉及基因最多,有170個(gè)。兩種水平下(過(guò)氧化氫處理組和對(duì)照組)共差異表達(dá)的基因共2,570個(gè),其中上調(diào)的基因1,520個(gè),下調(diào)的基因1,020個(gè)。結(jié)果顯示,800μmol/L H_2O_2對(duì)斜帶石斑魚肝細(xì)胞的代謝和生物調(diào)控等相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行后續(xù)分析及預(yù)測(cè),為斜帶石斑魚生長(zhǎng)代謝及疾病預(yù)防等方面的研究提供了豐富的數(shù)據(jù)來(lái)源。
【學(xué)位授予單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4
【圖文】：

體內(nèi)部環(huán)境持續(xù)位于氧化應(yīng)激狀態(tài)，最終導(dǎo)致細(xì)胞增生和凋亡異常[22-24]。ROS 號(hào)分子，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種氧化還原代謝反應(yīng)，包括細(xì)胞應(yīng)激效應(yīng)、能量代答[25]。研究表明，物理和化學(xué)損傷因素均能導(dǎo)致生物體大量積存 ROS 和氧化動(dòng)物體內(nèi)其往往是導(dǎo)致細(xì)胞癌變的促進(jìn)劑和啟動(dòng)劑[26]。O2是動(dòng)物體內(nèi) ROS 的主要存在形式，過(guò)氧化氫通過(guò)代謝產(chǎn)生的活性氧離子，極膜并與鐵離子結(jié)合形成更高活性自由基，從而誘發(fā)膜鈣離子通道異常開放，離引起細(xì)胞凋亡。此外，不是所有的 ROS 形式(羥自由基、超氧陰離子等)都能發(fā)號(hào)應(yīng)答功能。由于 H2O2代謝產(chǎn)生活性自由基有半衰期長(zhǎng)、氧化還原電位較低小等突出特點(diǎn)，因此在細(xì)胞內(nèi)可以較穩(wěn)定的透過(guò)細(xì)胞膜擴(kuò)散到其他細(xì)胞引起更這些特殊的理化特性決定了其在抗氧化研究中的重要性。研究還發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物細(xì)受濃度在不同物種間表現(xiàn)出高度的保守性(見圖 1)[28]。此外，H2O2及其代謝產(chǎn)由幾種定位于胞內(nèi)不同區(qū)域的酶類產(chǎn)生或清除的 ROS，這表明胞內(nèi)的 H2O2濃閉隔室”調(diào)控。簡(jiǎn)而言之，H2O2作為一種長(zhǎng)效的小分子信號(hào)，可能是細(xì)胞重要的關(guān)鍵性調(diào)控信號(hào)因子[29, 30]。

位論文 過(guò)氧化氫誘導(dǎo)斜帶石斑魚肝細(xì)胞氧化損傷的轉(zhuǎn)錄組學(xué)酶復(fù)合體 I 和Ⅲ中“逃逸”出來(lái)，將分子細(xì)胞中的分子氧還原成超氧陰成強(qiáng)氧化性的 H2O2。在細(xì)胞中特定鐵和銅復(fù)合物的反應(yīng)下，H2O2被轉(zhuǎn)更強(qiáng)的羥自由基( OH)[33, 34]。由此可知細(xì)胞內(nèi) ROS 的最初來(lái)源都是 O2 產(chǎn)生和清除受到嚴(yán)格調(diào)控。細(xì)胞中存在著多種有效的抗氧化防御機(jī)制，這對(duì)應(yīng)的各種抗氧化酶來(lái)完成，主要有超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化還蛋白過(guò)氧化物酶(Prx)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(G氨酸連接酶(GCLC、GCLM)等[30]。這些酶定位于細(xì)胞內(nèi)的各個(gè)區(qū)域來(lái)強(qiáng)活性氧的水平。(見圖 2)

碩士學(xué)位論文 過(guò)氧化氫誘導(dǎo)斜帶石斑魚肝細(xì)胞氧化損傷的轉(zhuǎn)錄NA-Seq 技術(shù)優(yōu)點(diǎn)年發(fā)展起來(lái)的基于基因組的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)即高通量測(cè)序技術(shù)[51]。、重復(fù)性高、可檢測(cè)范圍廣以及定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[52]。而且對(duì)所有物種都因組序列信息未知的物種也同樣適用。例如利用 RNA-Seq 中 454 測(cè)序的 Vera 等人研究[53]。此外，對(duì)于已知基因組序列信息的這些 reads，在參上直接可以匹配到，隨后對(duì)其進(jìn)行拼接組裝，或通過(guò)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量來(lái)對(duì)于沒(méi)有參考基因組的那些 reads 就必須進(jìn)行 de novo 組裝。如圖 1-3 所

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 駱源;張春曉;王玲;張冬玲;霍振華;宋凱;;斜帶石斑魚肝細(xì)胞分離及原代培養(yǎng)方法的建立[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);2016年04期

2 黃建;湯茜;姚卓鳳;張俊梅;顧澤茂;袁軍法;;水霉菌感染鯉誘導(dǎo)氧化應(yīng)激發(fā)生的研究[J];湖北農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年22期

3 羅輝;葉華;肖世俊;鄭曙明;王曉清;王志勇;;轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物研究中的運(yùn)用[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);2015年04期

4 許建;趙建;徐禮鳴;崔軍;李強(qiáng);朱新平;徐鵬;;基于RNA-Seq技術(shù)的鯪轉(zhuǎn)錄組分析[J];大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào);2014年06期

5 齊曉龍;趙芹;張亞男;武書庚;岳洪源;張海軍;齊廣海;;過(guò)氧化氫誘導(dǎo)產(chǎn)蛋雞原代肝細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立[J];中國(guó)畜牧雜志;2013年11期

6 張春蘭;秦孜娟;王桂芝;紀(jì)志賓;王建民;;轉(zhuǎn)錄組與RNA-Seq技術(shù)[J];生物技術(shù)通報(bào);2012年12期

7 王國(guó)強(qiáng);王雯;;應(yīng)激反應(yīng)對(duì)魚類影響的研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年24期

8 任國(guó)誠(chéng);陳松林;沙珍霞;;半滑舌鰨肝臟細(xì)胞系的建立與鑒定[J];高技術(shù)通訊;2008年06期

9 喻文娟;李聃;王翔凌;張寧;邱軍強(qiáng);楊先樂(lè);;大口黑鱸原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)及其應(yīng)用于CYP450活性的誘導(dǎo)[J];海洋漁業(yè);2008年01期

10 陳君慧;王克堅(jiān);周紅玲;任洪林;楊明;;花鱸肝臟hepcidin相關(guān)cDNA Hepc2的克隆及序列分析[J];中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2007年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 金鹿;維生素A對(duì)奶牛乳腺硒蛋白合成及抗氧化功能影響機(jī)理的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

2 王秋舉;L-肉堿對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的兩種魚細(xì)胞抗氧化功能影響及其機(jī)理研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 許寶紅;感病草魚脾臟的比較轉(zhuǎn)錄組分析[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 葉寒青;花鱸肌肉生長(zhǎng)抑素基因（MSTN）克隆、表達(dá)及其基因打靶載體的構(gòu)建[D];中國(guó)海洋大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前6條

1 吳宏清;基于RNA-Seq技術(shù)的國(guó)產(chǎn)沉香轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)字基因表達(dá)譜分析[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

2 文金隆;天麻酚性成分對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究[D];云南中醫(yī)學(xué)院;2013年

3 崔素麗;高溫下大黃素對(duì)團(tuán)頭魴生長(zhǎng)、血液指標(biāo)及抗氨氮應(yīng)激的影響[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 馮連華;低鹽環(huán)境對(duì)斜帶石斑魚幼魚生長(zhǎng)、生理的影響[D];廣東海洋大學(xué);2012年

5 張淞琳;斜帶石斑魚養(yǎng)殖生物學(xué)及人工苗種培育技術(shù)研究[D];集美大學(xué);2012年

6 孔江紅;復(fù)方中草藥對(duì)斜帶石斑魚生長(zhǎng)性能及非特異性免疫功能的影響[D];集美大學(xué);2011年

本文編號(hào)：2805158