【摘要】：1.H_2O_2誘導(dǎo)斜帶石斑魚肝細胞氧化損傷模型的建立通過不同的過氧化氫培養(yǎng)濃度(0、100、200、400、600、800、1000μmol/L)和作用時間(2、4、6、8、12、24 h)探索適宜的斜帶石斑魚肝細胞氧化損傷濃度和時間,以建立的斜帶石斑魚原代肝細胞氧化損傷模型,并檢測培養(yǎng)過程中肝細胞的數(shù)量和活性的變化。采用單因子完全隨機設(shè)計實驗,根據(jù)臺盼藍對死細胞拒染法利用血球計數(shù)板測定細胞活力及數(shù)量,并通過MTT法測定細胞存活率。結(jié)果顯示,800μmol/L H_2O_2,作用8 h,斜帶石斑魚肝細胞的存活率降低至61.98%。2.H_2O_2對斜帶石斑魚原代肝細胞活性及功能的影響本研究采用斜帶石斑魚原代肝細胞模型,主要探究過氧化氫對原代培養(yǎng)的肝細胞氧化損傷機制的影響。通過測定不同培養(yǎng)時間下過氧化氫不同作用濃度的肝細胞或培養(yǎng)上清液中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、脂質(zhì)過氧化物(LPO)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)的變化,分析細胞生長代謝狀態(tài)。結(jié)果顯示,使用過氧化氫處理后其他各組與800μmol/L和1000μmol/L組相比顯著降低了CAT、GSH-PX和SOD活性,顯著升高LPO、MDA含量(P0.05),但是800和1000μmol/L組之間沒有顯著差異(P0.05)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):H_2O_2過氧化氫作用時間為8 h、作用濃度為800μmol/L,使斜帶石斑魚原代肝細胞產(chǎn)生了明顯的氧化應(yīng)激,該條件可作為建立斜帶石斑魚肝細胞氧化損傷模型的適宜條件。3.利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究過氧化氫對肝細胞差異表達影響本研究以過氧化氫為刺激源誘導(dǎo)建立了斜帶石斑魚肝細胞氧化損傷模型,試驗基于RNA-Seq技術(shù)對正常處理組(L-15)和對照組(800μmol/L H_2O_2)的斜帶石斑魚肝細胞進行測序,利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)深度分析細胞內(nèi)部基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及過氧化氫處理后細胞表型和功能的改變。結(jié)果顯示,通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),對83,802,103條原始reads的篩選和排除,拼接獲得到了112,618條Unigenes,平均長度為957.45 bp,N50為1,687 bp。按照Blast等相關(guān)軟件,對數(shù)據(jù)進行相關(guān)分析后,共得到功能注釋基因110,560個。依據(jù)GO富集分析發(fā)現(xiàn),差異表達基因主要被集中在代謝通路、細胞過程、生物調(diào)控等通路中,在KEGG pathway富集分析中結(jié)果顯示,代謝通路涉及基因最多,有170個。兩種水平下(過氧化氫處理組和對照組)共差異表達的基因共2,570個,其中上調(diào)的基因1,520個,下調(diào)的基因1,020個。結(jié)果顯示,800μmol/L H_2O_2對斜帶石斑魚肝細胞的代謝和生物調(diào)控等相關(guān)基因表達產(chǎn)生影響。本實驗對差異表達的基因進行后續(xù)分析及預(yù)測,為斜帶石斑魚生長代謝及疾病預(yù)防等方面的研究提供了豐富的數(shù)據(jù)來源。
【學(xué)位授予單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4
【圖文】：

體內(nèi)部環(huán)境持續(xù)位于氧化應(yīng)激狀態(tài)，最終導(dǎo)致細胞增生和凋亡異常[22-24]。ROS 號分子，參與調(diào)控細胞內(nèi)多種氧化還原代謝反應(yīng)，包括細胞應(yīng)激效應(yīng)、能量代答[25]。研究表明，物理和化學(xué)損傷因素均能導(dǎo)致生物體大量積存 ROS 和氧化動物體內(nèi)其往往是導(dǎo)致細胞癌變的促進劑和啟動劑[26]。O2是動物體內(nèi) ROS 的主要存在形式，過氧化氫通過代謝產(chǎn)生的活性氧離子，極膜并與鐵離子結(jié)合形成更高活性自由基，從而誘發(fā)膜鈣離子通道異常開放，離引起細胞凋亡。此外，不是所有的 ROS 形式(羥自由基、超氧陰離子等)都能發(fā)號應(yīng)答功能。由于 H2O2代謝產(chǎn)生活性自由基有半衰期長、氧化還原電位較低小等突出特點，因此在細胞內(nèi)可以較穩(wěn)定的透過細胞膜擴散到其他細胞引起更這些特殊的理化特性決定了其在抗氧化研究中的重要性。研究還發(fā)現(xiàn)，動物細受濃度在不同物種間表現(xiàn)出高度的保守性(見圖 1)[28]。此外，H2O2及其代謝產(chǎn)由幾種定位于胞內(nèi)不同區(qū)域的酶類產(chǎn)生或清除的 ROS，這表明胞內(nèi)的 H2O2濃閉隔室”調(diào)控。簡而言之，H2O2作為一種長效的小分子信號，可能是細胞重要的關(guān)鍵性調(diào)控信號因子[29, 30]。

位論文 過氧化氫誘導(dǎo)斜帶石斑魚肝細胞氧化損傷的轉(zhuǎn)錄組學(xué)酶復(fù)合體 I 和Ⅲ中“逃逸”出來，將分子細胞中的分子氧還原成超氧陰成強氧化性的 H2O2。在細胞中特定鐵和銅復(fù)合物的反應(yīng)下，H2O2被轉(zhuǎn)更強的羥自由基( OH)[33, 34]。由此可知細胞內(nèi) ROS 的最初來源都是 O2 產(chǎn)生和清除受到嚴(yán)格調(diào)控。細胞中存在著多種有效的抗氧化防御機制，這對應(yīng)的各種抗氧化酶來完成，主要有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化還蛋白過氧化物酶(Prx)、谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽過氧化物酶(G氨酸連接酶(GCLC、GCLM)等[30]。這些酶定位于細胞內(nèi)的各個區(qū)域來強活性氧的水平。(見圖 2)

碩士學(xué)位論文 過氧化氫誘導(dǎo)斜帶石斑魚肝細胞氧化損傷的轉(zhuǎn)錄NA-Seq 技術(shù)優(yōu)點年發(fā)展起來的基于基因組的轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)即高通量測序技術(shù)[51]。、重復(fù)性高、可檢測范圍廣以及定量準(zhǔn)確等優(yōu)點[52]。而且對所有物種都因組序列信息未知的物種也同樣適用。例如利用 RNA-Seq 中 454 測序的 Vera 等人研究[53]。此外，對于已知基因組序列信息的這些 reads，在參上直接可以匹配到，隨后對其進行拼接組裝，或通過轉(zhuǎn)錄本的表達量來對于沒有參考基因組的那些 reads 就必須進行 de novo 組裝。如圖 1-3 所

【參考文獻】

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本文編號：2805158