【摘要】：自然界中,真菌所處的環(huán)境的pH值一直處于不斷變化之中,這種改變對(duì)真菌的生長(zhǎng)、發(fā)育、次生代謝等生理活動(dòng)具有非常重要的影響；為了生存和繁衍,真菌必須適應(yīng)不斷改變的酸堿環(huán)境。因而,研究真菌對(duì)酸堿環(huán)境的適應(yīng)機(jī)理,是認(rèn)知其生命活動(dòng)規(guī)律的重要內(nèi)容。本研究在昆蟲(chóng)病原真菌球孢白僵菌中,克隆了一個(gè)酸堿響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因BbPacC,通過(guò)表達(dá)特性檢測(cè)、基因敲除、回復(fù)突變和超量表達(dá)等方法對(duì)該基因進(jìn)行了功能分析,主要結(jié)果如下：1.BbPacC基因的克隆與表達(dá)特性通過(guò)同源克隆的方法獲得BbPacC基因及其上下游序列共3990 bp(Genbank登錄號(hào)：JX145340)。序列分析結(jié)果顯示,該基因的DNA序列全長(zhǎng)為1890 bp,包含2個(gè)內(nèi)含子,其開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)1773 bp,編碼的蛋白含590個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白的等電點(diǎn)(PI)為8.2,分子量為63.5 kDa。通過(guò)對(duì)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),該蛋白分子與蛹蟲(chóng)草的PacC的同源性達(dá)到85%,推測(cè)該蛋白為球孢白僵菌的PacC同源蛋白。定量PCR結(jié)果表明,在球孢白僵菌生長(zhǎng)發(fā)育的早期,BbPacC的表達(dá)受到抑制或處于很低的水平；隨著時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)入中后期,其表達(dá)水平逐漸增加到較高的水平(8倍左右)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)BbPacC的表達(dá)受酸性條件的抑制,受鹽堿條件的誘導(dǎo),表明BbPacC與菌株鹽堿脅迫相關(guān)。2.BbPacC對(duì)鹽堿脅迫適應(yīng)性的影響用CZA培養(yǎng)時(shí),BbPacC敲除菌株在堿性(pH 8.0)及鹽脅迫(1 M NaCl)條件下的生長(zhǎng)明顯減慢。通過(guò)對(duì)鹽脅迫響應(yīng)蛋白Na+/K+-P型ATPase的基因的啟動(dòng)子區(qū)域,進(jìn)行DNA序列分析,結(jié)果顯示該區(qū)域含有5個(gè)PacC特異識(shí)別位點(diǎn)；定量PCR也證實(shí)Na+/K+-P型ATPase基因的表達(dá)受BbPacC的調(diào)控。這些結(jié)果表明：BbPacC對(duì)菌株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)具有負(fù)調(diào)節(jié)作用,并可能通過(guò)調(diào)節(jié)Na+/K+-P型ATPase基因的表達(dá)影響菌株的酸堿適應(yīng)性及耐鹽性。3.BbPacC對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響B(tài)bPacC影響菌絲生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)貧瘠培養(yǎng)基(CZB)中,基因敲除菌株生長(zhǎng)比野生菌株快,而超量表達(dá)菌株的生長(zhǎng)卻受到明顯抑制。BbPacC影響分生孢子萌發(fā)和附著胞形成基因敲除菌株分生孢子(10.67 h)的萌發(fā)中時(shí)比野生型菌株(9.64 h)延長(zhǎng)了1.03 h；觀察附著胞形成率,發(fā)現(xiàn)基因敲除菌株比野生菌株下降了46.96%；表明BbPacC對(duì)孢子萌發(fā)和附著胞的形成具有正調(diào)節(jié)作用。BbPacC影響分生孢子的形成基因敲除菌株的產(chǎn)孢量比野生型菌株提高了107.34%,而超量表達(dá)菌株則下降了17.80%。通過(guò)對(duì)產(chǎn)孢關(guān)鍵基因fluG的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行序列分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在PacC蛋白的特異識(shí)別位點(diǎn)；并且該基因在BbPacC基因敲除菌株中的表達(dá)水平明顯提高,比野生菌株增加近4倍。這些結(jié)果表明BbPacC可能通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)的方式調(diào)控fluG的表達(dá),進(jìn)而影響菌株的產(chǎn)孢。4. BbPacC對(duì)毒力的影響B(tài)bPacC影響菌株致死率通過(guò)體表侵染的方法,發(fā)現(xiàn)基因敲除菌株對(duì)大蠟螟幼蟲(chóng)的半致死時(shí)間LT50(123.99 h)較野生型菌株(97.89h)延長(zhǎng)了26.66%,而超量表達(dá)菌株和野生菌株無(wú)明顯差異,表明BbPacC基因參與對(duì)菌株的毒力的調(diào)節(jié)。BbPacC影響草酸的合成基因敲除菌株發(fā)酵液的草酸含量較野生型降低11.09%,而超量表達(dá)菌株草酸含量增加了125.00%。利用溴甲酚紫作為指示劑檢測(cè)菌株生長(zhǎng)代謝對(duì)培養(yǎng)基pH的影響,發(fā)現(xiàn)無(wú)論在1/4SDB還是在CZB中,基因敲除菌株所生長(zhǎng)的培養(yǎng)基顏色均呈藍(lán)色。測(cè)定pH顯示,培養(yǎng)基因敲除菌株后的CZB培養(yǎng)基呈中性,而野生型和超量表達(dá)菌株的培養(yǎng)基呈酸性。在草酸的生物合成途徑中存在兩個(gè)重要基因草酰乙酸水解酶(OAH)和丙酮酸羧化酶(PYC)通過(guò)分別對(duì)兩個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行DNA序列分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者均含有PacC蛋白的特異結(jié)合位點(diǎn)。定量PCR結(jié)果顯示,這兩個(gè)基因在BbPacC超量表達(dá)菌株中的表達(dá)水平顯著高于野生菌株,達(dá)到野生菌株的2-6倍。上述結(jié)果表明,BbPacC可能通過(guò)調(diào)節(jié)OAH和PYC基因的表達(dá)來(lái)影響菌株草酸的合成。BbPacC調(diào)節(jié)堿性絲氨酸蛋白酶基因Serp的表達(dá)利用脫脂奶粉作為檢測(cè)底物觀察菌落水解圈形成情況,發(fā)現(xiàn)基因敲除菌株菌落水解圈大小明顯大于野生菌株,說(shuō)明敲除BbPacC后,通過(guò)改變環(huán)境pH來(lái)誘導(dǎo)菌株分泌性蛋白酶基因的表達(dá)。通過(guò)對(duì)堿性絲氨酸蛋白酶Serp基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行DNA序列分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在6個(gè)PacC結(jié)合位點(diǎn),而且Serp基因在BbPacC基因敲除菌株中的表達(dá)水平明顯提高,而在超量表達(dá)菌株中的水平明顯降低。以上結(jié)果說(shuō)明,BbPacC對(duì)堿性絲氨酸蛋白酶Serp等基因的表達(dá)具有間接調(diào)節(jié)作用。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S476.1
【圖文】：

逡逑ｅＭ／．，２００７）。Ｐａｌｌ如何協(xié)助ＰａｌＨ錨定在質(zhì)膜的呢？有三種可能，如圖１．２所示，（１）逡逑限制ＰａｌＨ的內(nèi)吞：ＰａｌＨ可能通過(guò)內(nèi)吞的方式到達(dá)內(nèi)膜上，而Ｐａｌｌ為了保證內(nèi)膜上逡逑ＰａｌＨ分子數(shù)量適中，會(huì)阻止過(guò)多ＰａｌＨ分子的內(nèi)吞；（２）促進(jìn)ＰａｌＨ的回收：Ｐａｌｌ逡逑協(xié)助ＰａｌＨ回到質(zhì)膜上；（３）協(xié)助ＰａｌＨ脫離高爾基體：Ｐａｌｌ協(xié)助ＰａｌＨ以分泌囊泡逡逑的形式從高爾基體到質(zhì)膜上。以上三種可能均需要ＰａｌＨ和Ｐａｌｌ有直接或間接的互逡逑作。逡逑曹逡逑＾Ｅｎｄｏｓｏｍｅ邋Ｖｊ邋Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ逡逑（ｋ逡逑Ｖ（邋Ｇｏｌｇｌ邋ｓｔａｃｋｓ逡逑ＴｔｉＬＮＯＳ邋ｔｎ邋Ｍｈ；ｒｏｂ＊ｏｔｃｇｙ逡逑圖１．２邋Ｐａｌｌ促進(jìn)Ｐａｍ錨定質(zhì)膜的三種可能機(jī)制（Ｐｅｆｉａｌｖａ邋ｅｔａｌ．，邋２００８）．逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｐａｉｌ邋ａｓｓｉｓｔｓ邋ｔｈｅ邋ｐｌａｓｍａ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＰａｌＨ邋ｂｙ邋ｔｈｒｅｅ邋ｐｏｓｓｉｂｌｅ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ邋（Ｐｅｎａｌｖａ邋ｅｔ邋ａ／．，逡逑２００８）．逡逑ｐＨ信號(hào)途徑的內(nèi)膜上存在轉(zhuǎn)運(yùn)必需的內(nèi)體分選復(fù)合物（ＥＳＣＲＴ），Ａａｒｏｎ逡逑Ｍｉｔｃｈｅｌｌ團(tuán)隊(duì)在啤酒酵母中的研究，發(fā)現(xiàn)了邋ＥＳＣＲＴ－Ｉ型和ＥＳＣＲＴ－ＩＩ型的所有成分，逡逑以及邋ＥＳＣＲＴ－ｍ邋型的邋Ｖｐｓ３２ｐ￣Ｖｐｓ２０ｐ邋亞基（Ｘｕ邋ｅｔ邋ａｉ，邋２００４）＝邋Ｖｐｓ３２邋結(jié)合在內(nèi)膜上，逡逑與邋ＥＳＣＲＴ－ＩＩ邋型、ＥＳＣＲＴ－ＩＩＩ邋型的邋Ｖｐｓ２０邋相互作用（Ｔｅｏ邋ｅｔ邋ａｉ

邐１逡逑０．０５逡逑圖４．１．２邋ＢｂＰａｃＣ與其它真菌Ｐａｃｅ同源蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析圖中進(jìn)行比對(duì)分析的真菌分別為蜂綠僵菌（Ｍ逡逑ａｃｒｉｄｕｍ）、金龜子綠僵菌（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ邋ａｎｉｓｏｐＵａｅ）、稻曲菌（Ｖｉｌｌｏｓｉｄａｖａ邋ｖｉｒｅｎｓ）、麥角菌（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓｐｕｒｐｕｒｅａ、、逡逑深綠木霉（７！邋ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）、哈茨木霉（７！邋ｈａｒｚｉａｎｕｍ）＾鞭毛藻叢赤殼菌邋（Ｎｅｃｔｒｉａ邋ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ、、邋尖孢鐮刀菌逡逑｛Ｆｕｓａｒｉｕｍ邋ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、、輪狀鐮刀菌ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）和稻瘟菌（Ｍ邋ｏｒｙｚａｅ）ｙ黑色框表示球抱白僵菌（５．逡逑ｂａｓｓｉａｎａ）？逡逑Ｆｉｇ．邋４．１．２邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｏｆ邋ＢｂＰａｃＣ邋ａｎｄ邋ＰａｃＣ邋ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｆｒｏｍ邋ｏｔｈｅｒ邋ｆｕｎｇｉ．邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ逡逑ｃｈａｒｔ邋ｗｅｒｅ邋ｆｒｏｍ邋Ｍ．邋ａｃｒｉｄｕｍ，Ｍ邋ａｎｉｓｏｐｌｉａ’邋Ｖ．邋ｖｉｒｅｎｓ，邋Ｃ．邋ｐｕｒｐｕｒｅａ，邋Ｔ．邋ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ，邋Ｔ．邋ｈａｎｉａｍｍ，Ｎ．邋ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ，Ｆ．逡逑ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ，Ｆ．邋ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅＳｙ邋Ｍ．邋ｏｒｙｚａｅ，邋ｔｈｅ邋ｂｌａｃｋ邋ｂｏｘ邋ｒｅｆｅｒｒｅｄ邋ｔｏ邋Ｂ．邋ｂａｓｓｉａｎａ．逡逑４．２邋ＢｂＰａｃＣ的表達(dá)特性檢n,逡逑在２６°Ｃ，用ＳＤＡ培養(yǎng)，檢測(cè)球孢白僵菌在生長(zhǎng)和產(chǎn)孢過(guò)程中ＢｂＰａｃＣ的表達(dá)逡逑情況，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)水平在菌株生長(zhǎng)的早期（３ｄ）較低，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)（６逡逑ｄ、９（１、１２邋ｄ）而逐漸增加

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