【摘要】：生菜在世界上廣泛種植,是一種重要的葉用蔬菜。在生產(chǎn)上具有十分重要的價值。生菜在進化過程中出現(xiàn)了各式各樣的類型,因此具有豐富的葉型,為研究生菜葉裂提供了豐富的材料。野生種生菜莖富集有較多的刺,而在栽培種中這種性狀卻丟失了,這為研究生菜的進化提供了很好的材料。目前生菜葉型的多樣性及莖刺的丟失分子機制尚未明確。在本研究中,主要通過構(gòu)建不同F(xiàn)_2代分離群體克隆控制莖刺和葉裂的目的基因。研究結(jié)果如下:1.關(guān)于葉裂性狀的研究:選擇兩組不同的葉型親本PI491070(葉完整)、PI536760(葉裂)和散葉PI536720(葉半裂)、W46(葉完整)進行雜交得到F1代,F1代自交得到F_2代;從F_2分離群體中各選取30株葉裂和葉完整的植株構(gòu)建兩個極端池,對兩個極端池提取RNA并測序,將測序得到的RNA-seq數(shù)據(jù)回帖到生菜基因組,計算等位基因SNP位點在兩個池中的頻率。根據(jù)此原理,通過分析等位基因SNP頻率差異在不同染色體上的分布,發(fā)現(xiàn)控制兩種不同的葉裂方式的基因定位在同一區(qū)域:3號染色體的90Mb到140Mb之間。利用4000株P(guān)I491070(葉完整)×PI536760(葉裂)F_2大群體最終將目的基因定位在116.24Mb到118.15Mb之間。對該區(qū)段內(nèi)進行候選基因的預(yù)測與分析,發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)存在24個基因,其中基因LG3316063主要參與鋅指蛋白的構(gòu)成,該基因在兩親本中有1個堿基的差異導(dǎo)致了氨基酸的改變。隨機挑選12個不同葉裂與葉完整的品種,該基因的基因型與表型變化一致。推測該基因可能是控制葉裂形成的候選基因。2.關(guān)于莖刺性狀的研究:本研究發(fā)現(xiàn)生菜莖刺是由多細胞組成。采用同樣的BSR-seq分析方對莖刺性狀進行遺傳分析。選擇491245(有刺)和W111(無刺)兩親本,構(gòu)建F_2分離群體,從F_2群體中各選取30株有刺(顯性)和無刺(隱性)的植株構(gòu)建兩個極端池,對兩個極端池提取RNA并測序,將目的基因初步定位在Chr5:304.36Mb-311.96Mb區(qū)域,利用3500株F_2代大群體進行精細定位,進一步將目的基因定位306.31Mb-307.31Mb之間。在定位區(qū)段內(nèi)通過基因表達分析,發(fā)現(xiàn)基因LG5467628在兩個親本中的差異很大,因此認為該基因是候選基因。
【圖文】：

圖 1-1 轉(zhuǎn)座子標簽法克隆技術(shù)流程[37]Fig.1-1 The process of cloning gene in transposon tagging[37]1.3.3 同源序列分析法同源序列法（Homology-based cloning）是指根據(jù)不同物種之間基因序列基因序列具有高度保守性，根據(jù)已知序列對目的基因進行克隆的方法。1992 年 Johal 利用同原序列法在玉米中成功克隆出抗圓斑病基因 Hm1[38]，此后利用此方法在不同物種中又相繼克隆了大約 100 多個抗病基因[39]，通過對發(fā)現(xiàn)的抗病基因結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的抗病基因含有保守結(jié)構(gòu)域：富亮氨酸重復(fù)序列（Leucine-Rich Repeat，LRR）、核苷酸結(jié)合位點（Nucleotide Binding Site，NBS）、絲氨酸－蘇氨酸激酶（Serine／Threonine Kinase，STK）、亮氨酸拉鏈（Leucine Zippers，LZ）、跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmem-Brane Domain，TM）[40]，，同源克隆法就是在這基礎(chǔ)之上發(fā)展來的。利用同源序列分析法已經(jīng)克隆許多物種的目的基因，擬南芥育性相關(guān)基因 AP3 基因和抗病毒基因 eIF4E 基因等等都相繼成功被克隆出來[41,42,43,44]。

生菜葉裂與莖刺性狀的遺傳定位3 結(jié)果與分析3.1 生菜葉裂性狀調(diào)查對實驗室種植的 1000 余份生菜資源進行葉裂形態(tài)的調(diào)查，共發(fā)現(xiàn)約 60 份材料具有葉裂的表型。葉裂性狀主要集中分布在野生生菜和散葉型生菜類型中。不同基因型生菜，其葉裂方式呈現(xiàn)多樣化（如圖 1-2），并且其葉裂的程度深淺有較大變化。雖然，在擬南芥關(guān)于葉裂基因已經(jīng)克隆，但是生菜葉裂多樣性的分子機理還不清楚，這就為我們研究生菜的葉裂提供了豐富的材料，為進一步開展本課題奠定了良好的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S636.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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2 鐘軍,李h,官春云;基因克隆技術(shù)的研究進展[J];生命科學(xué)研究;2002年S2期

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本文編號：2568903