【摘要】：CXCL8是一種CXC趨化因子,可激活和趨化中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。中性粒細(xì)胞可向感染處聚集并參與炎癥反應(yīng),該反應(yīng)受CXCL8的調(diào)節(jié),迅速、強(qiáng)烈,是宿主防御的第一道防線。但是,炎癥過程中過量的中性粒細(xì)胞浸潤也會(huì)導(dǎo)致過度炎癥反應(yīng),導(dǎo)致宿主組織細(xì)胞被破壞。在大部分豬病發(fā)生發(fā)展過程中,炎癥是最主要的病理變化,而CXCL8在這些疾病過程中也起重要的作用。大白豬是我國養(yǎng)豬業(yè)重要的豬種之一,目前對大白豬CXCL8的研究報(bào)道比較少。本研究克隆了大白豬CXCL8基因,對CXCL8及CXCL8的突變體(G58P)進(jìn)行可溶性表達(dá),并驗(yàn)證了它們的生物學(xué)活性,為進(jìn)一步研究豬CXCL8的功能與作用機(jī)制,開發(fā)抑制豬炎癥的靶向性藥物提供了基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容如下:1大白豬CXCL8及G58P的克隆與表達(dá)純化提取大白豬肺組織m RNA,利用RT-PCR擴(kuò)增CXCL8基因。測序正確后將該基因克隆至p GEX-6p-1載體上,獲得重組質(zhì)粒p GEX-PCXCL8。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta中,經(jīng)表達(dá)條件的優(yōu)化,外源基因在上清中高效表達(dá)。通過蛋白純化系統(tǒng)AKTA prime 10純化目的蛋白,SDS-PAGE及Western Blot顯示蛋白純化效果較好。將CXCL8第58位甘氨酸(G)突變?yōu)楦彼?P),根據(jù)相應(yīng)的堿基序列合成CXCL8突變體基因G58P,利用DNA重組技術(shù)將其克隆至p GEX-6p-1載體上,按照上述方法表達(dá)純化G58P蛋白。2 CXCL8的體內(nèi)活性驗(yàn)證將重組蛋白用生理鹽水稀釋到4mg/m L、400μg/m L、40μg/m L、4μg/m L,分別以25μL不同濃度的PCXCL8重組蛋白對BALB/c小鼠進(jìn)行滴鼻,同時(shí)設(shè)置相同濃度的GST蛋白對照組及生理鹽水空白對照組。12h后剖殺所有小鼠,取肺進(jìn)行組織病理學(xué)觀察,BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù),肺組織MPO活力檢測來評估重組蛋白的生物學(xué)活性。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度的PCXCL均可引起小鼠肺炎,4mg/m L GST組有輕微的炎癥,其余濃度GST組與生理鹽水對照組沒有明顯異常;PCXCL8實(shí)驗(yàn)組MPO活力均顯著高于GST對照組及生理鹽水組;4mg/m L PCXCL8滴鼻組BALF中性粒細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GST組。3 G58P的體內(nèi)活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)組以4mg/m L濃度G58P 25μL劑量滴鼻處理BALB/c小鼠,同時(shí)設(shè)置PCXCL8陽性對照組,PCXCL8與G58P混合組,生理鹽水對照組,不作處理的空白對照組。12h后剖殺所有小鼠,取肺臟。通過組織病理學(xué)觀察,BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù),肺組織MPO活力檢測來評估G58P的生物學(xué)活性。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組、混合組、PCXCL8對照組均呈現(xiàn)肺炎特征,生理鹽水對照組與空白對照組沒有明顯異常;實(shí)驗(yàn)組、混合組、PCXCL8對照組MPO活力無顯著差異,但均顯著高于生理鹽水對照組和空白對照組;實(shí)驗(yàn)組、混合組、PCXCL8對照組BALF中性粒細(xì)胞數(shù)目無顯著差異,但均顯著高于生理鹽水對照組和空白對照組。結(jié)論:利用原核表達(dá)載體p GEX-6p-1,可以對PCXCL8與G58P進(jìn)行可溶性表達(dá),所獲得PCXCL8與G58P蛋白都具有良好的生物學(xué)活性;PCXCL8第58位氨基酸G-P突變不能對其生物學(xué)活性產(chǎn)生重要影響。
【圖文】：

其中 72 個(gè)氨基酸的 CXCL8 生物學(xué)活性最強(qiáng)，即通常所指的成熟 CXCL8（MoWS etal，1989）。二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α螺旋和β片層，有肝素交聯(lián)，無糖基，氨基末端和羧基末端均為絲氨酸，等電點(diǎn)為 pH8.0～8.5。X 線晶體衍射與核磁共振顯示其三維結(jié)構(gòu)為六個(gè)反向平行的α片層和兩個(gè)對稱且反向平行的β螺旋二聚體，如圖 1。各種形式的 CXCL8 均對應(yīng)有這 72 個(gè)氨基酸殘基，在氨基酸的第 7、9、34 和 50 位上均存在 4 個(gè)保守的半胱氨酸殘基。天然狀態(tài)下，在第 7 和 34 位（Cys-7/Cys-34）、第9 和 50 位（Cys-9/Cys-50）之間形成鏈內(nèi)二硫鍵（Baggiolini M et al，1992）。如果這些二硫鍵被還原，則 CXCL8 的活性消失。根據(jù) 4 個(gè)半胱氨酸殘基中前兩個(gè)殘基排列順序的不同，CXCL8 又可分為α、β兩個(gè)亞家族，α亞家族因前兩個(gè)半胱氨酸殘基之間插入了一個(gè)其他氨基酸殘基，故被稱為 C-X-C 亞家族；β亞家族的前兩個(gè)半胱氨酸殘基彼此相鄰，故又稱為 C-C 亞家族（Baggiolini M et al，，1992；David R et a2008；Russo RC et al，2010）。有很多趨化因子都能和 CXCL8 的趨化因子受體CXCR1/CXCR2 結(jié)合，稱作 CXCL8 家族趨化因子，它們有一個(gè)共同的 ELR+（谷氨酸-亮氨酸-精氨酸）基序（Russo RC et al，2010；Bachelerie F et al，2013）。研究表明只有哺乳動(dòng)物的 CXCL8 才帶有 ELR+基序。

圖 3 以 CXCR1 和 CXCR2 為中心介導(dǎo)器官特異性疾病。Fig.3 Central role of CXCR1 and CXCR2 mediating organ-specific pathologies.CXCL8 家族和 CXCR1/2 受體調(diào)節(jié)各種特異器官疾病，大多數(shù)有害影響與高度強(qiáng)烈的慢性免疫反應(yīng)和組織損傷有關(guān)，也有一部與實(shí)質(zhì)細(xì)胞激活有關(guān)（紅色框）。然而，CXCR1/2 受體的激活也能帶來一些積極的影響，例如維持組織穩(wěn)態(tài)，通過 CXCL8 家族的多效作用平衡各種病理組織損傷（藍(lán)色框）。CXCL8 family and CXCR1/CXCR2 receptors regulate various specific organs diseases, mos
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S828

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 魏晶;陳紀(jì)飛;李強(qiáng);安英;李芳;;小鼠克雷白桿菌肺炎模型的建立及檢測[J];中國免疫學(xué)雜志;2014年01期

2 苗雪;官杰;;IL-8的研究進(jìn)展[J];齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年22期

3 郭艷麗,宋善俊;IL-8與腫瘤[J];國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊);2004年11期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 趙杰;草魚IL-8基因在炎癥反應(yīng)中的功能研究[D];蘇州大學(xué);2014年

2 邵萬平;CXCR1/CXCR2受體拮抗劑-G31P對豚鼠肺炎克雷伯桿菌肺炎的抑制作用[D];大連醫(yī)科大學(xué);2010年

3 李偉;CXCR1/CXCR2受體拮抗劑-G31P對小鼠綠膿桿菌肺炎的治療[D];大連醫(yī)科大學(xué);2008年

4 李雯;榮昌豬及內(nèi)江豬白細(xì)胞介素-8的克隆、原核表達(dá)以及生物學(xué)活性分析[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2567105