【摘要】：傳染性胰腺壞死病(Infectious Pancreatic Necrosis,IPN)是由傳染性胰腺壞死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus,IPNV)引起的一種主要危害鮭鱒魚苗的高致死性疾病。自上世紀(jì)八十年代傳入中國至今仍沒有有效的防控藥物,而由于毒株存在變異及安全因素,國外商品化疫苗無法直接引進(jìn)及應(yīng)用。本課題組于2013年IPN暴發(fā)期間在中國云南省某虹鱒養(yǎng)殖場分離到一株IPNV強(qiáng)毒(命名為ChRtm213)。本文對該毒株的全基因組序列進(jìn)行了測定與分析,并在此基礎(chǔ)上利用反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建了重組IPNV病毒(rChRtm213)。本研究對全面了解IPNV的結(jié)構(gòu)與功能、揭示IPNV致病與免疫的分子機(jī)制等相關(guān)的研究具有重要意義。本研究利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)方法,從IPNV-ChRtm213細(xì)胞培養(yǎng)物的總RNA中獲得了ChRtm213基因組片段并進(jìn)行了序列測定,與GenBank中IPNV序列進(jìn)行了比對,并運(yùn)用軟件對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。序列分析結(jié)果表明,ChRtm213毒株的全基因組序列包含一個(gè)A鏈(3099 bp)編碼多聚蛋白VP2-VP4-VP3,和一個(gè)B鏈(2789 bp)編碼一個(gè)RNA依賴的RNA聚合酶VP1蛋白。系統(tǒng)發(fā)育分析表明,ChRtm213屬于基因1型,血清型為A9(Jasper),和日本IPNV毒株AM98具有最高的同源性,其中A鏈與B鏈相似性分別為96.3%和97.3%。本研究通過In-Fusion無縫連接的方法成功構(gòu)建了以T7 RNA聚合酶介導(dǎo)的IPNV高效反向遺傳操作系統(tǒng)。分別在ChRtm213株A、B鏈上引入分子沉默性標(biāo)簽并將其克隆在真核表達(dá)載體(NDV vector)的T7啟動(dòng)子下游,構(gòu)建了ChRtm213-NDV-A和ChRtm213-NDV-B重組質(zhì)粒,然后通過LipofectamineTM2000(Invitrogen)介導(dǎo),與表達(dá)T7RNA聚合酶的真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染CHSE-214細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后96 h利用新的單層CHSE-214繼續(xù)擴(kuò)增。通過噬斑純化鑒定、電鏡觀察、間接免疫熒光檢測、酶切分子標(biāo)簽檢測證明了重組IPNV的存在。本研究成功構(gòu)建了IPNV高效反向遺傳操作系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有穩(wěn)定、簡便等特點(diǎn),能在CHSE-214上高效獲得重組病毒。
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S943

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉淼;徐黎明;趙景壯;曹永生;劉紅柏;尹家勝;盧彤巖;;虹鱒傳染性胰臟壞死病毒的分離鑒定及聚類分析[J];大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào);2017年01期

2 張琳琳;連科迅;張英;蔣燁;姜艷萍;崔文;喬薪瑗;唐麗杰;李一經(jīng);劉敏;;傳染性胰壞死病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立[J];淡水漁業(yè);2014年04期

3 胡曉利;李偉;肇慧君;吳斌;;虹鱒魚傳染性胰臟壞死病病毒的分離與鑒定[J];中國動(dòng)物檢疫;2012年03期

4 徐曄;段宏安;周毅;劉亭歧;姚燕林;;實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測魚類傳染性胰臟壞死病病毒方法的建立[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年31期

5 王旭;顏其貴;雷燕;;魚類傳染性胰腺壞死病的病毒學(xué)特征、診斷及防治研究[J];水產(chǎn)科學(xué);2010年09期

6 劉敏;趙麗麗;葛俊偉;歐笛;王相清;劉弈;張偉;李一經(jīng);;傳染性胰腺壞死病毒VP3蛋白的干酪乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建[J];淡水漁業(yè);2008年05期

7 劉玉良,劉秀梵;RNA病毒反向遺傳操作技術(shù)研究進(jìn)展[J];病毒學(xué)報(bào);2004年01期

8 范寶昌,楊佩英;RNA病毒的反向遺傳學(xué)操作[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2001年03期

9 劉興發(fā),李紅衛(wèi),鐘志宏,侯順利,臧榮鑫,趙衛(wèi)平;虹鱒魚傳染性胰腺壞死病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)的建立[J];中國獸醫(yī)科技;1997年11期

10 江育林;于平;李正秋;;用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)快速檢測虹鱒的傳染性胰臟壞死病病毒[J];水生生物學(xué)報(bào);1990年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 祁小樂;雞傳染性法氏囊病病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立及基因功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2007年

，

本文編號(hào)：2564546