【摘要】：病害是造成水稻減產(chǎn)的主要原因之一,研究和發(fā)掘水稻自身抗病相關(guān)基因可為培育優(yōu)良的抗性品種提供新的途徑。CCCH型鋅指蛋白廣泛的存在于真核生物中,在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)逆境的應(yīng)答過程中扮演重要角色。雖然植物生理學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)C3H12是水稻中首個(gè)參與抗病反應(yīng)的CCCH型鋅指蛋白,但仍缺少生化和結(jié)構(gòu)等分子機(jī)理層面研究,對(duì)其結(jié)合底物類型、活性部位和與底物的結(jié)合模式并不了解。本研究首先構(gòu)建了C3H12全長(zhǎng)基因的原核表達(dá)載體,表達(dá)和初步純化得到C3H12(WT)。其次,合成了生物素標(biāo)記的可能與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA底物ARE19、nonamer和micro RNA mimics N.C,利用RNA EMSA方法研究C3H12與底物相互作用。最后,對(duì)C3H12的氨基酸序列進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析,根據(jù)其串聯(lián)鋅指排列相對(duì)位置對(duì)基因進(jìn)行了缺失突變,構(gòu)建和表達(dá)缺失突變蛋白C3H12ΔC201-439、C3H12ΔN1-329、C3H12Δ201-329、C3H12ΔN1-77C408-439,研究不同結(jié)構(gòu)區(qū)域在底物結(jié)合中的作用。實(shí)驗(yàn)中取得的結(jié)果如下:(1)使用PCR和overlap PCR等方法對(duì)C3H12(WT)蛋白以及其截短突變蛋白C3H12ΔC201-439、C3H12ΔN1-329、C3H12Δ201-329、C3H12ΔN1-77C408-439進(jìn)行原核表達(dá)載體構(gòu)建,獲得載入目的片段且分別帶有MBP標(biāo)簽和His標(biāo)簽的p MAL和p ET32原核表達(dá)載體,測(cè)序所得結(jié)果正確。(2)探索蛋白在天然培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的誘導(dǎo)條件和純化方案,發(fā)現(xiàn)蛋白可以在30℃以下溫度穩(wěn)定表達(dá),大腸桿菌可以獲取天然培養(yǎng)基中的鋅,不需要額外提供鋅離子。MBP標(biāo)簽和His標(biāo)簽蛋白的純化不能采用實(shí)時(shí)穿流過柱的常規(guī)親和層析方法,蛋白需要與柱材做低溫條件下兩小時(shí)以上的孵育才能與柱材結(jié)合。親和、離子交換、凝膠過濾以及疏水等層析等常規(guī)方法盡管可以將標(biāo)簽和目的條帶分開,但不能除去雜蛋白,暗示雜蛋白與目的蛋白可能存在結(jié)合。采用0.3%濃度表面活性劑sarkosyl處理后,獲得單一條帶蛋白。(3)合成了可能與蛋白互作的RNA底物,標(biāo)記并純化底物ARE19、nonamer和micro RNA mimics N.C,點(diǎn)印記試驗(yàn)表明獲得生物素成功標(biāo)記的底物。(4)運(yùn)用RNA-EMSA方法研究C3H12與ARE19的互作,發(fā)現(xiàn)C3H12結(jié)合ARE19類型的底物。缺失突變蛋白的EMSA試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C3H12ΔC201-439不與底物結(jié)合,而C3H12ΔN1-329、C3H12Δ201-329、C3H12ΔN1-77C408-439與底物結(jié)合。表明C3H12底物結(jié)合部位為突變蛋白C3H12ΔN1-329。C3H12Δ201-329與底物結(jié)合,表明長(zhǎng)141氨基酸特殊間隔在底物結(jié)合上不起直接關(guān)鍵作用,暗示它的存在可能與其它蛋白互作有關(guān)。以上結(jié)果揭示C3H12的C端110個(gè)氨基酸片段參與ARE19類型底物結(jié)合,可進(jìn)一步使用NMR手段解析該小分子量蛋白結(jié)構(gòu),為底物結(jié)合模式研究奠定基礎(chǔ),也給水稻自身抗病研究提供分子機(jī)制上的理論支持。
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【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S435.11
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本文編號(hào)：2490305