【摘要】：病害是造成水稻減產(chǎn)的主要原因之一,研究和發(fā)掘水稻自身抗病相關基因可為培育優(yōu)良的抗性品種提供新的途徑。CCCH型鋅指蛋白廣泛的存在于真核生物中,在植物的生長發(fā)育和對逆境的應答過程中扮演重要角色。雖然植物生理學研究已發(fā)現(xiàn)C3H12是水稻中首個參與抗病反應的CCCH型鋅指蛋白,但仍缺少生化和結構等分子機理層面研究,對其結合底物類型、活性部位和與底物的結合模式并不了解。本研究首先構建了C3H12全長基因的原核表達載體,表達和初步純化得到C3H12(WT)。其次,合成了生物素標記的可能與目標蛋白結合的RNA底物ARE19、nonamer和micro RNA mimics N.C,利用RNA EMSA方法研究C3H12與底物相互作用。最后,對C3H12的氨基酸序列進行了結構分析,根據(jù)其串聯(lián)鋅指排列相對位置對基因進行了缺失突變,構建和表達缺失突變蛋白C3H12ΔC201-439、C3H12ΔN1-329、C3H12Δ201-329、C3H12ΔN1-77C408-439,研究不同結構區(qū)域在底物結合中的作用。實驗中取得的結果如下:(1)使用PCR和overlap PCR等方法對C3H12(WT)蛋白以及其截短突變蛋白C3H12ΔC201-439、C3H12ΔN1-329、C3H12Δ201-329、C3H12ΔN1-77C408-439進行原核表達載體構建,獲得載入目的片段且分別帶有MBP標簽和His標簽的p MAL和p ET32原核表達載體,測序所得結果正確。(2)探索蛋白在天然培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的誘導條件和純化方案,發(fā)現(xiàn)蛋白可以在30℃以下溫度穩(wěn)定表達,大腸桿菌可以獲取天然培養(yǎng)基中的鋅,不需要額外提供鋅離子。MBP標簽和His標簽蛋白的純化不能采用實時穿流過柱的常規(guī)親和層析方法,蛋白需要與柱材做低溫條件下兩小時以上的孵育才能與柱材結合。親和、離子交換、凝膠過濾以及疏水等層析等常規(guī)方法盡管可以將標簽和目的條帶分開,但不能除去雜蛋白,暗示雜蛋白與目的蛋白可能存在結合。采用0.3%濃度表面活性劑sarkosyl處理后,獲得單一條帶蛋白。(3)合成了可能與蛋白互作的RNA底物,標記并純化底物ARE19、nonamer和micro RNA mimics N.C,點印記試驗表明獲得生物素成功標記的底物。(4)運用RNA-EMSA方法研究C3H12與ARE19的互作,發(fā)現(xiàn)C3H12結合ARE19類型的底物。缺失突變蛋白的EMSA試驗發(fā)現(xiàn)C3H12ΔC201-439不與底物結合,而C3H12ΔN1-329、C3H12Δ201-329、C3H12ΔN1-77C408-439與底物結合。表明C3H12底物結合部位為突變蛋白C3H12ΔN1-329。C3H12Δ201-329與底物結合,表明長141氨基酸特殊間隔在底物結合上不起直接關鍵作用,暗示它的存在可能與其它蛋白互作有關。以上結果揭示C3H12的C端110個氨基酸片段參與ARE19類型底物結合,可進一步使用NMR手段解析該小分子量蛋白結構,為底物結合模式研究奠定基礎,也給水稻自身抗病研究提供分子機制上的理論支持。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S435.11
，

本文編號：2490305