【摘要】：植物病原菌引起的植物病害每年給作物產量及質量帶來巨大的損失,生物防治途徑對作物的植物病害具有很好的防治效果,越來越受到人們的關注。但是植物病害的生物防治劑的商業(yè)使用和應用一直很緩慢,獲得廣譜、高效的抑制植物病害的生防菌仍是一個挑戰(zhàn)。本研究通過平板對峙法篩選出一株對12種植物病原真菌具有高效、廣譜抗性的拮抗菌AnH,經生理生化試驗以及16S rRNA測序鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens);拮抗菌AnH無菌發(fā)酵液中的抗菌物質耐高溫和強酸強堿,經強光和紫外線照射后活性穩(wěn)定,對蛋白酶K不敏感,且保存3個月對抗菌物質活性幾乎沒有影響,為以后田間實驗打下基礎;AnH同時具有纖維素酶和蛋白酶活性,對拮抗菌的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,得到最適宜的發(fā)酵條件為玉米粉15 g/L,酵母膏15 g/L,硫酸鎂2 g/L,抑菌圈直徑達18.1 mm;采用有機溶劑萃取法,硫酸銨沉淀法,鹽酸沉淀法分離提取抗菌物質,結果表明其為水溶性物質,此外實驗結果表明脂肽類粗提物能廣譜抑制12種植物病原真菌的生長。采用凝膠過濾、LC-MS對其進行分離純化分析得到分子量m/z1042.5、1056.5、1070.5三者分子量相差14 Da,正好是一個-CH2基團的大小,這符合脂肽類物質同系物的特征,這些結果暗示從拮抗菌AnH分離出來的抗菌物質是伊枯草菌素同系物。陜西白鹿原櫻桃樹出現(xiàn)了一種感染率高,蔓延快但發(fā)病機制尚不清楚的“黑疙瘩”病害,當?shù)剞r民采用多種化學方法防治效果不佳。本研究采用微生物學分離技術對10棵患病櫻桃樹病組織進行分離培養(yǎng),共分離得到135株細菌,進而通過形態(tài)、生理生化反應合并為不同的27株細菌,對其進行16S rRNA測序結果顯示:23株為Enterobacteriaceae,其中 Pantoeasp.11 株,Enterobactersp.6 株,Salmonellasp.3 株,Escherichia sp.3株。病組織中的優(yōu)勢細菌屬于Enterobacteriaceae;分離得到的8株真菌ITS測序結果顯示:2株Wickerhamoms,2株Meyerozyma,1株Botryosphaeria dothidea,2 株 Fungal sp.,1 株 Gibberella。其中的真菌Botryosthea 是可引起多種果樹患病的致病菌。用拮抗菌AnH的脂肽類及蛋白粗提物對病組織分離的細菌和真菌進行抑菌試驗,結果顯示拮抗菌AnH的脂肽類粗提物對其都有很好的抑菌作用。以上研究表明,拮抗菌AnH具有很好的應用潛能,為控制櫻桃樹“黑疙瘩”病及植物病害的發(fā)生提供了一定的科學依據和理論依據。
[Abstract]:Plant diseases caused by plant pathogens bring huge losses to crop yield and quality every year. Biological control methods have a good control effect on plant diseases of crops, and more attention has been paid to them. However, the commercial use and application of biological control agents for plant diseases have been slow. It is still a challenge to obtain a broad spectrum of biological control agents that can effectively control plant diseases. In this study, an antagonistic strain AnH, which was highly effective and broad-spectrum resistant to 12 plant pathogenic fungi, was screened out by plate confrontation method and identified as Bacillus amylase (Bacillus amyloliquefaciens); by physiological and biochemical tests and 16s rRNA sequencing. The antibacterial substance in aseptic fermentation broth of antagonistic strain AnH was high temperature resistant and strong acid and alkali. After irradiation with strong light and ultraviolet light, its activity was stable, it was not sensitive to protease K, and it had little effect on the activity of antibacterial substance after 3 months' storage. To lay the foundation for future field experiment; AnH had both cellulase and protease activity. The optimal fermentation conditions were as follows: corn meal 15 g / L, yeast extract 15 g / L, magnesium sulfate 2 g / L, and the optimal fermentation conditions were as follows: corn meal 15 g / L, yeast extract 15 g / L, magnesium sulfate 2 g / L. The diameter of bacteriostatic ring is up to 18.1 mm;. The antibacterial substances were separated and extracted by organic solvent extraction, ammonium sulfate precipitation and hydrochloric acid precipitation, and the results showed that they were water-soluble. In addition, the results showed that the lipopeptide crude extracts could inhibit the growth of 12 phytopathogenic fungi by broad spectrum. By gel filtration and LC-MS separation and purification, the molecular weight difference of molecular weight (MW) was 1042.5, 1056.5 and 1070.5, and the difference of molecular weight was just the size of a-CH2 group, which was consistent with the characteristic of lipopeptide homologue. These results suggest that the antibacterial substance isolated from antagonistic bacteria AnH is a homologue of eosinosporin. A kind of "black pimple" disease, which has a high infection rate and spread quickly but the pathogenesis is not clear, has appeared in the cherry tree of the White Deer Plantation in Shaanxi Province. Many chemical methods used by the local farmers are not effective in the prevention and control of black pimple. In this study, the microbiological isolation technique was used to isolate and culture 10 infected cherry tree disease tissues. 135 strains of bacteria were isolated, and then 27 different strains of bacteria were combined by morphological, physiological and biochemical reactions. The results of 16s rRNA sequencing showed that 23 Enterobacteriaceae, strains were Pantoeasp.11, Enterobactersp.6, Salmonellasp.3 and Escherichia sp.3. The dominant bacteria in the tissues belonged to 8 fungal ITS strains isolated from Enterobacteriaceae;. Sequencing results showed that two Wickerhamoms,2 strains, Meyerozyma,1 strain, Botryosphaeria dothidea,2 strain, Fungal sp.,1 strain, Gibberella., were isolated from the infected tissues. The fungus Botryosthea is one of the pathogenic bacteria which can cause many kinds of fruit tree diseases. The lipopeptide and crude protein extracts of antagonistic bacterium AnH were used to test the bacteriostatic activity of bacteria and fungi isolated from the disease tissue. The results showed that the crude lipopeptide extracts of antagonistic bacteria AnH had good bacteriostatic effect on the bacteria and fungi. The results showed that the antagonistic bacterium AnH had good application potential and provided scientific and theoretical basis for controlling the occurrence of "black pimple" disease and plant disease in cherry trees.
【學位授予單位】：西北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S476;S436.629

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