【摘要】：雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的RNA干擾(RNAi,RNA interference)技術(shù)通過dsRNA誘導(dǎo)序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默,已成為昆蟲基因功能研究的重要手段,在害蟲防治領(lǐng)域亦具有潛在的應(yīng)用價值。一些研究表明,昆蟲通過胞吞作用吸收dsRNA,H_2O_2能提升細(xì)胞對dsRNA的吸收;脂質(zhì)體保護dsRNA,克服與細(xì)胞膜之間的靜電斥力進入細(xì)胞;殼聚糖與dsRNA形成的納米顆�？梢杂行ПＷodsRNA,提升對dsRNA的轉(zhuǎn)運能力。同時,高溫、低溫、大腸桿菌等誘導(dǎo)可引起RNAi通路相關(guān)基因諸如Dicer-2、Ago-2和R2D2等的表達(dá)上調(diào),從而激活RNAi。目前,對桔小實蠅進行RNAi多采用注射法和飼喂法,而dsRNA介導(dǎo)的RNAi在雙翅目昆蟲普遍存在沉默效率不高、持效性差等問題。據(jù)此,本學(xué)位論文選取桔小實蠅3個不同類型的基因,包括組成性表達(dá)的肌動蛋白基因Actin-2、脂肪體和馬氏管特異性高表達(dá)的羧酸酯酶基因CarE-6以及在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)的神經(jīng)肽基因Natalisin,對桔小實蠅注射添加不同介質(zhì)的dsRNA以及桔小實蠅經(jīng)高低溫或E.coli誘導(dǎo)處理后注射dsRNA,采用RT-qPCR技術(shù)檢測3個基因的RNAi效率,通過分析獲得提高不同類型基因RNAi效率的技術(shù)方案,為基于注射法的RNAi技術(shù)研究桔小實蠅基因的功能提供技術(shù)基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1、三種介質(zhì)對桔小實蠅RNAi效率的時間效應(yīng)在1.5μg 4000 ng/μL的dsRNA中分別添加H_2O_2(100 nL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%)、Lipofectamine RNAimax(dsRNA與其質(zhì)量體積比4:1)和Chitosan(質(zhì)量體積比濃度0.02%)后對桔小實蠅進行混合注射,采用RT-qPCR技術(shù)檢測靶標(biāo)基因在注射后12 h、24 h、48 h和72 h的RNAi效率。結(jié)果表明,添加3種介質(zhì)后,不同基因在不同檢測時間點的RNAi效率存在差異。其中,添加H_2O_2后,Actin-2在72 h的RNAi效率得到提升,CarE-6在48 h的RNAi效率得到提升,Natalisin在12h、24h和48h的RNAi效率得到提升,但與單獨注射dsRNA相比較差異不顯著。添加Lipofectamine RNAimax后,Actin-2在48 h的RNAi效率提升,CarE-6在48 h和72 h的RNAi效率得到提升,Natalisin在48 h的RNAi效率得到顯著提升,在72 h的RNAi效率得到提升。添加Chitosan后,Actin-2在48 h和72 h的RNAi效率得到提升,CarE-6在72 h的RNAi效率得到提升,Natalisin在48 h的RNAi效率得到顯著提升,在72 h的RNAi效率提升。說明添加H_2O_2、Lipofectamine RNAimax或殼聚糖可以提升桔小實蠅RNAi的效率。基于以上檢測結(jié)果,在后續(xù)條件優(yōu)化中,分別選取在注射dsActin 72 h、dsCarE 48 h和dsNatalisin 24 h后進行各基因RNAi效率的分析。注射不同劑量的dsRNA(0.5μg、1μg和1.5μg)后,3個基因的RNAi效率呈現(xiàn)dsRNA劑量依賴性,劑量越大,RNAi效率越高。2、三種介質(zhì)對桔小實蠅RNAi效率的劑量效應(yīng)在1.5μg 4000 ng/μL的dsRNA中分別添加不同劑量的H_2O_2、Lipofectamine RNAimax和Chitosan后對桔小實蠅進行混合注射,采用RT-qPCR技術(shù)檢測靶標(biāo)基因的RNAi效率。結(jié)果表明,對桔小實蠅注射dsRNA+H_2O_2(100 nL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%),3個基因的RNAi效率均有所提升,但差異不顯著;注射dsRNA+H_2O_2(100 nL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%和15%)后,RNAi效率均有所下降。說明注射在H_2O_2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時可以提升對靶標(biāo)基因的RNAi效率,但不作為首選技術(shù)方案。對桔小實蠅注射dsRNA+Lipofectamine RNAimax(質(zhì)量體積比2:1)后,3個基因的RNAi效率均顯著提升,該方案可作為桔小實蠅基于注射法的RNAi優(yōu)選方案。對桔小實蠅注射dsRNA+Chitosan后均能不同程度地提高對靶標(biāo)基因的RNAi效率。其中,dsActin添加Chitosan(質(zhì)量體積比濃度為0.08%)能夠顯著提升RNAi效率,添加3個濃度的殼聚糖均能顯著提升對靶標(biāo)基因CarE-6的RNAi效率,當(dāng)dsNatalisin添加Chitosan(質(zhì)量體積比濃度為0.02%、0.04%)時,能顯著提升對靶標(biāo)基因Natalisin的RNAi效率�；赗NAi效率與成本考慮,對于組織特異性高表達(dá)的基因CarE-6和Natalisin選擇添加質(zhì)量體積比濃度為0.02%的Chitosan,對于組成性表達(dá)的基因Actin-2選擇添加質(zhì)量體積比濃度為0.08%的Chitosan,以便獲得最佳的RNAi效果。3、E.coli或高低溫處理對桔小實蠅RNAi效率的影響對桔小實蠅注射不同體積的E.coli(OD600=1.0,100 nL、200 nL、400 nL)12h后,注射1.5μg 4000 ng/μL dsRNA,RT-qPCR分析結(jié)果顯示,100 nL E.coli+dsActin、100 nL/200 nL E.coli+dsCarE以及200 nL E.coli+dsNatalisin處理后,對3個基因的RNAi效率無顯著提升。200 nL/400 nL E.coli+dsActin、400nL E.coli+dsCarE以及100 nL/400 nL E.coli+dsNatalisin處理后,RNAi效率均有所降低。因此,E.coli誘導(dǎo)桔小實蠅不能有效提升對靶標(biāo)基因的RNAi效率。分別將桔小實蠅置于低溫12℃和高溫42℃處理30 min后注射dsRNA,27℃條件下注射dsRNA為對照。RT-qPCR結(jié)果顯示,與對照相比,高溫或低溫處理桔小實蠅會降低對靶標(biāo)基因的RNAi效率。因此,在室溫27℃條件下進行基于注射法的RNAi,能夠獲得較好的RNAi效率。綜上所述,針對不同類型的基因,為實現(xiàn)對靶標(biāo)基因的有效干擾,明確基因功能,推薦如下RNAi方案:(1)組成性表達(dá)的基因,27°C下,1.5μg 4000 ng/μL的dsRNA,混合注射dsRNA+Lipofectamine RNAimax(質(zhì)量體積比2:1),或混合注射dsRNA+Chitosan(質(zhì)量體積比濃度0.08%),注射后48 h-72 h檢測表型。(2)脂肪體和馬氏管特異性表達(dá)的基因,27°C下,1.5μg 4000 ng/μL的dsRNA,混合注射dsRNA+Lipofectamine RNAimax(質(zhì)量體積比2:1),或者混合注射dsRNA+Chitosan(質(zhì)量體積比濃度0.02%),注射后48 h-72 h檢測表型。(3)中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達(dá)的基因,27°C下,1.5μg 4000 ng/μL的dsRNA,混合注射dsRNA+Lipofectamine RNAimax(質(zhì)量體積比2:1),或者混合注射dsRNA+Chitosan(質(zhì)量體積比濃度0.02%),注射后12 h-72 h檢測表型。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S433

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2393893