【摘要】：開花是植物由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L的一個(gè)重要階段,開花時(shí)間的時(shí)晚會(huì)影響產(chǎn)品器官的產(chǎn)量與品質(zhì)。芥菜開花整合子SUPPRESSOR OF CO OVEREXPRESSION1(SOC1)、開花抑制因子FLOWERING LOCUS C (FLC)和SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP)均編碼Type Ⅱ MADS-box型MIKC蛋白,在調(diào)控植株發(fā)育以及開花時(shí)間上起著非常重要的作用,但是它們調(diào)控芥菜開花時(shí)間的分子機(jī)制并不清楚。迄今為止,有關(guān)芥菜SOC1蛋白與SVP,FLC蛋白之間的作用機(jī)制仍未見報(bào)道。為了深入研究芥菜SOC1蛋白與開花負(fù)調(diào)控因子SVP及FLC蛋白互作的分子機(jī)理,本試驗(yàn)以‘青葉芥’為材料克隆了芥菜SOC1基因,構(gòu)建了SOC1、SOC1突變體及SVP突變體的酵母雙雜交重組表達(dá)載體和BiFC重組表達(dá)載體,并通過β-半乳糖苷酶活性測定了蛋白-蛋白相互作用強(qiáng)度,篩選并鑒定了SOC1分別與SVP, FLC蛋白的相互作用及其氨基酸作用位點(diǎn)。為深入研究SOCl在開花時(shí)間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。主要試驗(yàn)結(jié)果如下：1. 芥菜SOC1基因的亞克隆及生物信息學(xué)分析以芥菜莖尖總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板,擴(kuò)增得到SOCl基因的cDNA序列為639 bp,編碼213個(gè)氨基酸殘基,屬于MIKC型蛋白,與油菜和埃塞俄比亞芥的SOC1親緣關(guān)系最近。預(yù)測SOC1蛋白分子量大小為24.37 kDa,理論等電點(diǎn)為9.18。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析可知,芥菜SOC1蛋白中由氨基酸殘基形成的α螺旋占整個(gè)氨基酸殘基數(shù)56%,β折疊占10%,卷曲螺旋占34%。2.芥菜SOC1與SVP相互作用檢測構(gòu)建酵母表達(dá)載體pGBKT7-SOC1,通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)酵母中得到酵母轉(zhuǎn)化子Y2HGold(pGBKT7-SOC1),經(jīng)過毒性及自激活檢測,發(fā)現(xiàn)無自激活和毒性現(xiàn)象。將Y2HGold(pGBKT7-SOC1)與本實(shí)驗(yàn)室提供的Y187(pGADT7-SVP)融合后,二倍體酵母Y187(pGADT7-SVP)×Y2HGold(pGBKT7-SOCl)能在選擇型培養(yǎng)基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal/AbA(QDO/X/A)平板上長藍(lán)色菌落。同時(shí)分別構(gòu)建BiFC表達(dá)載體p2YC-SOC1和p2YN-SVP,通過冷熱刺激法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中。將這兩種菌液等量混合共浸潤4-6片真葉的本氏煙,48 h后通過激光共聚焦顯微鏡在488 nm激發(fā)光下觀察,發(fā)現(xiàn)共浸潤含p2YC-SOC1和p2YN-SVP的本氏煙草表皮細(xì)胞周圍發(fā)出黃色熒光。綜上說明,開花信號整合子SOC1與開花負(fù)調(diào)控因子SVP存在蛋白相互作用。3.芥菜SOC1與FLC相互作用檢測將Y2HGold(pGBKT7-SOC1)與本實(shí)驗(yàn)室提供的Y187(pGADT7-FLC)融合后,二倍體酵母Y187(pGADT7-FLC) X Y2HGold(pGBKT7-SOC1)能在選擇型培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp/AbA (DDO/A)、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp(QDO)平板上長白色菌落、但是不能在QDO/X/A平板上生長。同時(shí)構(gòu)建BiFC重組表達(dá)載體p2YN-FLC,通過冷熱刺激法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中。確定陽性克隆后,將這種菌液與含p2YC-SOC1的菌液等量混合共浸潤4-6片真葉的本氏煙草,48 h后通過激光共聚焦顯微鏡在488 nm激發(fā)光下觀察發(fā)現(xiàn),共浸潤含p2YC-SOC1和p2YN-FLC的本氏煙草表皮細(xì)胞不發(fā)光。綜上說明,開花信號整合子SOC1與開花負(fù)調(diào)控因子FLC不能相互作用。4.芥菜SOC1突變體與SVP相互作用檢測分別構(gòu)建SOC1V77K、SOC1P81K、SOC1K108V、SOC1R109L和SOC1C137K5個(gè)SOC1突變體,并構(gòu)建pGBKT7-SOC1突變體酵母表達(dá)載體。通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)酵母中得到酵母轉(zhuǎn)化子Y2HGold(pGBKT7-SOC1V77K), Y2HGold(pGBKT7-SOC1P81K), Y2HGold(pGBKT7-SOC1K108V), Y2HGold (pGBKT7-SOC1RI09L)以及Y2HGold(pGBKT7-SOC1C137K)。經(jīng)過毒性及自激活檢測,發(fā)現(xiàn)均無自激活和毒性現(xiàn)象。分別將這5個(gè)突變體的酵母轉(zhuǎn)化子與Y187(pGADT7-SVP)融合,發(fā)現(xiàn)二倍體酵母Y187(pGADT7-SVP)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1V77K)、 Y187(pGADT7-SVP)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1P81K)能在缺陷培養(yǎng)基QDO/X/A平板上長藍(lán)色菌落,而其他的融合菌落不能生長。同時(shí)分別構(gòu)建SOC1突變體的BiFC表達(dá)載體p2YC-SOC1V77K、p2YC-SOC1P81K、 p2YC-SOC1K108V、p2YC-SOC1R109L以及p2YC-SOC1C137K,通過冷熱刺激法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中。確定陽性克隆后,分別將每種菌液與含p2YC-SOC1的菌液等量混合共浸潤4～6片真葉的本氏煙草,48 h后通過激光共聚焦顯微鏡在488 nm激發(fā)光下觀察發(fā)現(xiàn),共浸潤含p2YC-SOC1V77K和p2YN-SVP、p2YC-SOC1P81K和p2YN-SVP的本氏煙草表皮細(xì)胞周圍發(fā)出黃色熒光,其他組合不發(fā)光。5.芥菜SVP突變體與SOC1相互作用檢測分別在SVP蛋白的K域構(gòu)建4個(gè)SVP點(diǎn)突變(SVPE90L、SVPK104C、SVPH1061、SVPR137L),并構(gòu)建pGADT7-SVP突變體酵母表達(dá)載體。通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)酵母中得到酵母轉(zhuǎn)化子Y187(pGADT7-SVPE90L)、Y187(pGADT7-SVPK104C)、 Y187(pGADT7-SVPH1061)以及Y187(pGADT7-SVPR137L),分別將這4個(gè)突變體的酵母轉(zhuǎn)化子與Y2HGold(pGBKT7-SOC1)融合,發(fā)現(xiàn)Y187(pGADT7-S VPE90L)、Y187(pGADT7-SVPK104C)、 Y187(pGADT7-SVPH1061)與Y2HGold(pGBKT7-SOC 1)的雜交組合能夠在QDO/X/A平板上長藍(lán)色菌落；二倍體酵母Y187(pGADT7-SVPR137L)×Y2HGold(pGBKT7-SOC1)不能在QDO/X/A平板生長。同時(shí)分別構(gòu)建SVP突變體的BiFC表達(dá)載體p2YN-SVPE90L、p2YN-SVPK104C、 p2YN-SVPH1061及p2YN-SVPR137L,通過冷熱刺激法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中。BiFC發(fā)現(xiàn)：共浸潤含p2YC-SOC1和p2YN-SVPE90L、p2YC-SOC1和p2YN-SVPK104C、p2YC-SOC1和p2YN-SVPH1061的本氏煙草表皮細(xì)胞發(fā)出黃色熒光,其他組合不發(fā)光。6.互作強(qiáng)度分析酵母β-半乳糖營酶活性檢測及方差分析表明：SOC1V77K、SOC1P81K突變體與SVP蛋白的作用強(qiáng)度均顯著高于非突變體SOC1,其中SOC1P81K突變體又顯著高于SOC1V77K;而SOC1的第108、109和137位氨基酸突變后(SOC1K108、SOC1R109L、SOC1C137K突變體)會(huì)導(dǎo)致SOC1與SVP的相互作用消失,說明SOC1的這五位氨基酸均能夠調(diào)節(jié)SOC1/SVP的聚合強(qiáng)度。SVPE90L、SVPK104C、SVPH1061突變體與SOC1蛋白的作用強(qiáng)度均顯著高于非突變體SVP,其中SVPK104C與SVPH1061之間差異不顯著,但是它們顯著高于突變體SVPE90L;而SVP的第137位氨基酸突變后(SVPR137L突變體)會(huì)導(dǎo)致SOC1與SVP的相互作用消失,說明SVP的這四位氨基酸均能夠調(diào)節(jié)SVP/SOC1的聚合強(qiáng)度。另外,SOC1V77K×SVP、SOC1P81K×SVP雜交組合的作用均顯著高于SOC1×SVPE90L、 SOC1×SVPK104C、SOC1×SVPH1061,說明SOC1第77位、81位氨基酸突變對SOC1/SVP聚合化的影響程度要顯著高于SVP的第90、104、106位突變。利用SOC1蛋白K域的點(diǎn)突變來調(diào)節(jié)SOC1/SVP聚合化的效果很可能比SVP要明顯。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2;S637

【參考文獻(xiàn)】

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1 湯青林;李念祖;丁寧;陳竹睿;宋明;王志敏;;芥菜開花調(diào)控蛋白SVP與FLC酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及其相互作用研究[J];園藝學(xué)報(bào);2012年06期

2 湯青林;李念祖;宋明;丁寧;陳竹睿;劉智宇;王志敏;;芥菜開花調(diào)控因子SVP與FLC蛋白互作的結(jié)構(gòu)域篩選與鑒定[J];園藝學(xué)報(bào);2012年12期

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本文編號：2367618