本文關(guān)鍵詞：腦心肌炎病毒HB10株感染性cDNA克隆的構(gòu)建及其應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》 2015年

腦心肌炎病毒HB10株感染性cDNA克隆的構(gòu)建及其應(yīng)用

于會(huì)彬  

【摘要】：豬腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)宿主范圍廣,可以感染嚙齒類動(dòng)物、豬、大象和非靈長類動(dòng)物等。有報(bào)道稱人也可以被感染。EMCV是一個(gè)無囊膜的單股正鏈RNA病毒,屬于小RNA病毒科,心病毒屬。EMCV基因組全長約7.8 kb,含一個(gè)開放閱讀框(open reading fragment,ORF),ORF的兩邊為5'和3'UTR(非翻譯區(qū))。5'UTR含有一個(gè)介導(dǎo)病毒多聚蛋白起始合成的內(nèi)部核糖體介入位點(diǎn)(internal ribosome entry site,IRES)和一個(gè)poly(C)結(jié)構(gòu);3'UTR末端含有一個(gè)poly(A)尾巴。病毒的基因組編碼一個(gè)多聚蛋白前體,在3C蛋白酶的參與下裂解為P1,P2,和P3,但是首次裂解發(fā)生在蛋白的復(fù)制的延伸過程,早于3C蛋白酶的形成,裂解點(diǎn)位于2A和2B蛋白之間,由NPG(P)基序介導(dǎo)。本研究旨在利用反向遺傳操作技術(shù)建立EMCV-HB10株的c DNA感染性克隆。采用RT-PCR方法,一次性擴(kuò)增出EMCV-HB10株全長基因組(包括5'和3'UTR)序列,并直接克隆到低拷貝載體p OK12中,構(gòu)建含有全長EMCV HB10基因組的重組質(zhì)粒(p EMCV-C9)。該重組質(zhì)粒經(jīng)酶切線性化,體外轉(zhuǎn)錄為RNA。將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞中進(jìn)行拯救病毒。轉(zhuǎn)染細(xì)胞36 h后,出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變(cell pathogenic effect,CPE)。拯救病命名為r EMCV-C9并經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增并全基因組測序鑒定。5'UTR序列比對(duì)顯示,拯救病毒含有9 bp的poly(C),而親本病毒的poly(C)結(jié)構(gòu)為C7TCTC3TC10,長度為24 bp。該差別可以作為區(qū)別親本病毒EMCV-HB10和拯救病毒r EMCV-C9的一個(gè)基因標(biāo)志。除poly(C)的長度外其余序列均與親本病毒一致。間接免疫熒光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和生長曲線試驗(yàn)結(jié)果顯示,poly(C)長度減少不影響病毒的拯救,拯救病毒與親本病毒具有相似的生長特性。動(dòng)物感染試驗(yàn)結(jié)果顯示,r EMCV-C9的LD50是2×104 TCID50,為親本病毒EMCV-HB10的213倍,以上結(jié)果證明poly(C)的長度對(duì)病毒在BHK-21細(xì)胞上的生物學(xué)特性沒有顯著影響,但是縮短poly(C)降低了病毒對(duì)小鼠的致病力。重組拯救病毒r EMCV-C9得到了部分致弱。已有的研究表明,致弱的門戈病毒(Mengo virus)可以作為潛在的活病毒載體表達(dá)異源抗原�？s短poly(C)的EMCV感染性克隆平臺(tái)的建立為研究新型基因工程疫苗提供了有力的工具。EMCV-HB10在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)190次傳代和蝕斑克隆(plaque clone assay),我們成功獲得了一株克隆毒株,命名為EMCV-P190-C25。全病毒基因組測序表明,相對(duì)于親本病毒EMCV-HB10,EMCV-P190-C25的2A蛋白缺失了127個(gè)氨基酸,還有一些氨基酸發(fā)生突變。隨后我們將該病毒的部分基因克隆到p EMCV-C9骨架中,構(gòu)建了一個(gè)重組病毒載體,命名為p C9-P190-?2A。在VP1和Δ2A的序列之間依次插入了一個(gè)起始裂解點(diǎn),一個(gè)Flag標(biāo)簽和一個(gè)多克隆位點(diǎn),并命名為p C9-P190-Flag-MCS-?2A。該重組質(zhì)粒經(jīng)Bam H I線性化后,體外轉(zhuǎn)錄的RNA對(duì)BHK-21具有感染性,獲得的病毒命名為r C9-P190-Flag-MCS-?2A。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明,r C9-P190-Flag-MCS-?2A不引起小鼠死亡且無任何臨床癥狀。為檢測該病毒表達(dá)外源蛋白的能力,我們?cè)趐 C9-P190-Flag-MCS-?2A的多克隆位點(diǎn)插入720 bp的e GFP基因并成功拯救出重組病毒,命名為r C9-P190-Flag-e GFP-?2A,該病毒在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳代,5代內(nèi)仍然可以穩(wěn)定表達(dá)e GFP外源蛋白,western blot檢測表明,e GFP存在兩種表達(dá)形式,一種為GFP單獨(dú)表達(dá),一種為e GFP-VP1融合表達(dá)�？偨Y(jié)以上試驗(yàn)結(jié)果,我們成功構(gòu)建了EMCV-HB10的全長感染性克隆平臺(tái),利用蝕斑克隆方法分離了一個(gè)2A蛋白缺失毒株,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了一個(gè)無毒力的病毒載體,可以用于外源蛋白的表達(dá)和病毒感染的示蹤。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

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