本文關鍵詞：多拉菌素基因工程菌株的構建　出處：《南陽師范學院》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：多拉菌素(Doramectin)是一種新型大環(huán)內酯類抗寄生蟲藥物,可安全高效驅殺豬、牛、羊等家畜的體內和體表寄生蟲,已被廣泛應用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。多拉菌素是美國輝瑞公司研發(fā)的阿維菌素第三代衍生物,可由基因改造阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)發(fā)酵產(chǎn)生。我國是全球最大的阿維菌素生產(chǎn)基地,產(chǎn)能過剩,但相關企業(yè)普遍因技術原因無法實現(xiàn)產(chǎn)品更新?lián)Q代,國內多拉菌素市場仍主要依靠進口。阿維鏈霉菌bkdFGH基因編碼的支鏈α-酮酸脫氫酶參與阿維菌素起始單元的合成,其缺失突變可導致阿維鏈霉菌喪失產(chǎn)生阿維菌素的能力。但當在該突變菌株的發(fā)酵過程中添加環(huán)己烷甲酸為前體時,就可產(chǎn)生多拉菌素(CHC-B1),同時也會得到CHC-B2、CHC-A1和CHC-A2等無效的多拉菌素類似物。aveD基因編碼的C5-O-甲基轉移酶可介導多拉菌素B組分向A組分的轉化,從而降低發(fā)酵產(chǎn)物中多拉菌素的含量。此外,阿維鏈霉菌中功能未知基因aveC的特定位點突變也有可能提高產(chǎn)物中多拉菌素有效組分的比例。因此,為獲取能夠生產(chǎn)多拉菌素的菌株,應對阿維鏈霉菌中bkdFGH, aveD和aveC這三個基因進行改造。本研究以篩選獲得的阿維菌素高產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株,通過基因工程技術對多拉菌素合成基因bkdFGH, aveD和aveC進行改造,獲取能夠高效產(chǎn)生多拉菌素的工程菌株,并對其發(fā)酵條件進行初步優(yōu)化,為構建穩(wěn)定高效產(chǎn)生多拉菌素的工程菌株奠定基礎。取得的主要結果如下：1.利用同源雙交換法構建bkdFGH基因缺失阿維鏈霉菌突變菌株,在其發(fā)酵過程中添加外源前體環(huán)己甲酸,發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜檢測發(fā)現(xiàn)有多拉菌素(CHC-B1)產(chǎn)生,但同時還有CHC-A1和CHC-A2等無效組分。在此基礎上進而對aveD基因進行缺失,構建成功bkdFGH和aveD雙缺失突變株,檢測發(fā)現(xiàn)其仍可發(fā)酵產(chǎn)生多拉菌素(CHC-B1),但CHC-A1和CHC-A2等無效組分的含量顯著降低。2.在獲得bkdFGH和aveD雙缺失阿維鏈霉菌突變菌株的基礎上,采取兩種方法對aveC基因進行改造：1)利用同源雙交換將aveC基因缺失；2)利用全基因合成技術獲得包含10個突變位點的aveC*,然后將其整合入bkdFGH和aveD雙缺失突變株基因組中,獲取可高效表達aveC*的突變株。對其發(fā)酵產(chǎn)物分別進行檢測,發(fā)現(xiàn)aveC缺失可阻斷阿維鏈霉菌中多拉菌素的生物合成,這說明aveC對多拉菌素生物合成是必需的。而該基因的定點改造則能提高多拉菌素的產(chǎn)量,但并未顯著改變產(chǎn)物中CHC-B1和CHC-B2的比例。3.以上述突變菌株為研究對象,檢測發(fā)酵時間、氮源和無機鹽等因素對基因改造阿維鏈霉菌合成多拉菌素能力的影響,通過單因子實驗初步摸索最佳發(fā)酵條件。結果顯示：多拉菌素最佳發(fā)酵時間為13天,最佳單一氮源為棉籽粉,在培養(yǎng)基中添加七水合硫酸鋅可提高多拉菌素產(chǎn)量。
【學位授予單位】：南陽師范學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S859.79;Q78

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本文編號：1335816