本文關(guān)鍵詞：靶向整合素αvβ3新型探針制備及卵巢癌顯像和抗瘤血管藥效監(jiān)測研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：第一部分’8F標(biāo)記新型RGD二聚體(18F-RGD2)探針構(gòu)建及其在SKOV-3卵巢癌荷瘤鼠靶向顯像中的應(yīng)用研究研究背景卵巢癌發(fā)病率在全球婦科惡性腫瘤中排第二位,早期癥狀隱匿,發(fā)現(xiàn)時往往處于進(jìn)展期或者已經(jīng)擴(kuò)散。臨床研究證據(jù)表明卵巢癌對化療敏感,治療上一般采取手術(shù)切除后行卡鉑或紫杉醇輔助化療。而對于喪失手術(shù)機(jī)會的病人則直接采取化療療法。近年來盡管卵巢癌病人5年生存率有所改善,但死亡率仍居高不下。大量臨床試驗研究證實,抗腫瘤血管生成治療對各個分期的卵巢癌病人的預(yù)后都具有重要影響。近來研究證實,抗腫瘤血管生成治療聯(lián)合放化療,可以明顯增強(qiáng)抗腫瘤療效,改善預(yù)后。因此,目前臨床上急需一種無創(chuàng)性影像學(xué)檢查方法對腫瘤進(jìn)行早期檢測、監(jiān)測抗血管生成治療療效以及篩選適合進(jìn)行抗血管生成治療的腫瘤患者。近年研究表明,整合素αvβ3在腫瘤新生血管和某些類型的腫瘤細(xì)胞上高表達(dá),而在成熟的血管和正常組織無表達(dá)或者極低表達(dá)。RGD多肽是整合素avβ3的配體,可以高親和力與整合素αvβ3特異性結(jié)合,因此利用RGD多肽類探針進(jìn)行整合素αvβ3靶向顯像,對早期診斷腫瘤和監(jiān)測抗腫瘤藥物療效具有重要臨床價值。紫杉醇是最重要的一線抗癌藥物之一,但是其抗腫瘤機(jī)制迄今為止尚未完全闡明。目前認(rèn)為主要包括細(xì)胞周期停滯、誘導(dǎo)凋亡、使微管聚集。此外最新研究證實紫杉醇還有抗腫瘤新生血管生成作用。本論文合成一種新型18F標(biāo)記聚乙二醇修飾的RGD探針18F-FB-NH-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2(記為18F-RGD2),并研究了其在人卵巢癌SKOV-3荷瘤鼠模型中靶向腫瘤顯像及監(jiān)測抗血管生成藥物療效的作用及意義。實驗方法1、制備探針18F-RGD2將純化的18F-SFB溶于DMSO,然后添加NH2-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2(RGD2)的DMSO溶液和DIPEA,60℃加熱30 mmin,產(chǎn)物用Sep-Pak C-18柱進(jìn)行純化,并應(yīng)用radio-HPLC檢測放化純。2、建立荷瘤鼠模型選取4-6周齡的雌性裸鼠,左肩皮下注射含5×106個SKOV-3卵巢癌細(xì)胞的生理鹽水溶液,操作在通風(fēng)的無菌條件下完成,建模后進(jìn)行常規(guī)飼料喂養(yǎng)。腫瘤大小約50 mm3時進(jìn)行生物學(xué)分布研究。3、生物學(xué)分布研究及阻斷實驗荷瘤鼠尾靜脈注射1 MBq/0.1 ml 18F-RGD2,30 min、60 min、120 min后分批處死小鼠。采集腫瘤、血液、肌肉、骨、心臟、肝臟、肺、腎臟、腸等重要組織和器官,稱重后,用Y計數(shù)器進(jìn)行放射性計數(shù),計算%ID/g。阻斷實驗：另選SKOV-3荷瘤小鼠,每只尾靜脈同時注入1 MBq/0.1 ml劑量的18F-RGD2和過量未標(biāo)記的E[c(RGDfK)]2,60 min后處死小鼠,進(jìn)行生物學(xué)分布研究。4. MicroPET顯像兩組SKOV-3荷瘤鼠分別注射3.7 MBq/0.1 ml 18F-RGD2或者5 MBq/0.1 ml 18F-FDG,60 min后,腹腔內(nèi)注射0.6%戊巴比妥鈉,麻醉后行MicroPET掃描,掃描模式為靜態(tài)采集5 min。5、紫杉醇治療方案將紫杉醇溶于DMSO后用PBS緩沖液稀釋到所需濃度。將實驗小鼠分為治療組和對照組,每組12只。治療組給予0.1ml的紫杉醇(10mg/kg),對照組給予0.1ml的PBS溶液,每3天給藥一次,連續(xù)給藥6次。6、免疫組織化學(xué)分析將生物學(xué)分布研究中處死小鼠的腫瘤組織做免疫組織化學(xué)分析。將腫瘤組織4%多聚甲醛固定后,制備成石蠟切片,利用抗CD34抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,定量分析腫瘤的微血管密度。實驗結(jié)果1、成功合成新型18F標(biāo)記RGD探針18F-RGD2。2、生物學(xué)分布研究結(jié)果表明18F-RGD2在SKOV-3腫瘤組織明顯濃聚,腫瘤靶向性好。3、MicroPET顯像證實18F-RGD2在卵巢癌組織明顯聚集,18F-RGD2的T/NT(靶/非靶)比值明顯大于18F-FGD的T/NT比值。4、抗腫瘤血管生成治療后,治療組的腫瘤18F-RGD2攝取低于對照組,注射后60 min降低31.31%±7.18%(P=0.009),注射后120 min降低38.92%±8.31%(P0.001)。5、免疫組化染色證實SKOV-3腫瘤組織高表達(dá)CD34,紫杉醇抗血管生成治療后腫瘤組織CD34表達(dá)下降,微血管密度降低,與生物學(xué)分布結(jié)果一致。結(jié)論18F-RGD2具有較強(qiáng)的整合素αvβ3親和力,在腫瘤組織明顯濃聚,可用于抗腫瘤血管生成療效監(jiān)測和評價。第二部分99mTc-3PRGD2監(jiān)測不同抗腫瘤血管生成藥物療效的差異性研究研究背景近年來,靶向腫瘤新生血管藥物治療取得重大進(jìn)展,但是如何非侵入性實時監(jiān)測該類藥物的療效是臨床亟待解決的問題。通過標(biāo)記可與腫瘤細(xì)胞特異性靶點相結(jié)合的配體,引入機(jī)體后,通過影像學(xué)設(shè)備實時成像,可為臨床抗腫瘤治療提供重要參考。近年來,有關(guān)腫瘤特異性靶點研究有多項報道,其中研究最多,也最有潛力的是整合素αvβ3。整合素αvβ3主要表達(dá)在腫瘤新生血管和某些腫瘤細(xì)胞表面,而在成熟的血管和正常組織無表達(dá)或者極低表達(dá)。多項研究證實RGD多肽可與整合素αvβ3高效特異性結(jié)合,RGD多肽類探針可被用于各種模態(tài)的整合素αvβ3靶向顯像,進(jìn)行腫瘤早期診斷和治療療效監(jiān)測。多項研究報道RGD多肽類探針可有效監(jiān)測腫瘤化療或抗血管生成治療療效。這些研究涉及多種藥物治療和不同類型的腫瘤。一般認(rèn)為,RGD探針在腫瘤局部的濃聚程度反映腫瘤新生血管密度,是正相關(guān)關(guān)系,盡管研究證實RGD多肽類探針可有效監(jiān)測實體腫瘤的抗血管生成藥物治療療效,而且也已見臨床研究報道。但在前期體外細(xì)胞學(xué)實驗中,研究組發(fā)現(xiàn)抗血管生成藥物夫拉平度(細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑)與紫杉醇不同,在抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的同時,可以上調(diào)SKOV-3腫瘤細(xì)胞表面的整合素αvβ3表達(dá)。這種雙重效應(yīng)可能影響RGD多肽類探針監(jiān)測抗腫瘤血管生成治療療效的有效性和準(zhǔn)確性。論文第一部分已經(jīng)證實18F-RGD2用于卵巢癌SKOV-3荷瘤鼠模型腫瘤靶向顯像及監(jiān)測紫杉醇抗腫瘤血管生成治療療效的有效性。在第二部分,課題組嘗試通過利用目前比較成熟的放射性探針99mTc-3PRGD2,研究RGD多肽類探針監(jiān)測不同抗腫瘤血管生成藥物治療療效的有效性,并探討其在監(jiān)測不同抗腫瘤血管生成藥物療效中是否存在差異性及分子機(jī)理。研究方法1、制備探針99mTc-3PRGD299mTc-3PRGD2通過HYNIC-3PRGD2藥盒制備。將1ml 99mTcO4-溶液(25 mCi)加入到HYNIC-3PRGD2藥盒中,震蕩,溶解充分后100℃水浴加熱20 min,室溫冷卻5 min后放射性薄層紙層析法檢測放化純。2、建立荷瘤鼠模型選取4-6周齡的雌性裸鼠,左肩皮下注射含5×106個SKOV-3卵巢癌細(xì)胞生理鹽水溶液,建模操作在通風(fēng)的無菌條件先完成。建模后進(jìn)行常規(guī)飼料喂養(yǎng)。腫瘤大小約50 mm3時進(jìn)行生物學(xué)分布研究。3、抗血管生成治療方案將紫杉醇和夫拉平度用DMSO溶解,然后用PBS緩沖液稀釋到所需濃度。將24只荷瘤鼠隨機(jī)分為紫杉醇組、夫拉平度組和對照組,每組8只。紫杉醇組每次腹腔內(nèi)注射0.1 ml紫杉醇溶液(20mg/kg),夫拉平度組每次腹腔內(nèi)注射0.1m1夫拉平度溶液(5mg/kg),對照組裸鼠每次腹腔內(nèi)注射0.1 mlPBS緩沖液。每3天注射一次,共注射6次。4、生物學(xué)分布研究及阻斷實驗荷瘤鼠尾靜脈注射0.37 MBq/0.1 ml 99mTc-3PRGD2,2 h和4h后分批處死小鼠。采集采集腫瘤、血液、肌肉、骨、心臟、肝臟、肺、腎臟、腸等重要組織和器官,稱重后,用γ計數(shù)器進(jìn)行放射性計數(shù),計算%ID/g。另選SKOV-3荷瘤鼠4只,每只尾靜脈同時注入0.37 MBq/0.1 ml劑量的99mTc-3PRGD2和過量未標(biāo)記的E[c(RGDfK)]2,進(jìn)行阻斷實驗。5、免疫組織化學(xué)分析取生物學(xué)分布研究中處死的小鼠腫瘤組織做免疫組織化學(xué)分析。將腫瘤組織常規(guī)4%多聚甲醛固定后,制備成石蠟切片,進(jìn)行Ki-67、CD34和整合素αv抗體免疫組織化學(xué)染色,定量分析腫瘤增殖程度、微血管密度和整合素αvβ3表達(dá)。6、內(nèi)皮細(xì)胞管型形成實驗分別用含紫杉醇(100 mM)和夫拉平度(300 mM)的培養(yǎng)液培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),37 ℃,5% CO2培養(yǎng)24 h,然后通過內(nèi)皮細(xì)胞管型形成實驗檢測藥物在體外對HUVECs形成血管能力的影響。7、流式細(xì)胞術(shù)分析整合素avβ3表達(dá)分別用含紫杉醇(100 mM)和夫拉平度(300 mM)的培養(yǎng)液培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),37 ℃,5% CO2培養(yǎng)24 h,熒光抗體染色后通過流式細(xì)胞術(shù)測定藥物治療對SKOV-3腫瘤細(xì)胞表面整合素avβ3表達(dá)的影響。結(jié)果1、腫瘤體積測定及Ki-67免疫組化結(jié)果顯示紫杉醇和夫拉平度治療都減緩了腫瘤生長,明顯抑制SKOV-3細(xì)胞增殖,P0.05。2、CD34免疫組化染色及內(nèi)皮細(xì)胞管型形成實驗分別從體內(nèi)、體外證實了紫杉醇和夫拉平度都明顯降低血管生成,P0.05。3、紫杉醇治療后腫瘤放射性攝取明顯降低(2小時降低39.96%±8.23%,P=0.044；4小時降低35.76%±11.42%,P=0.024),而夫拉平度治療后腫瘤放射性攝取輕度升高(2小時升高4.42%±0.24%,P=0.898；4小時升高12.2%±1.84%,P=0.702)。4、免疫組化染色顯示紫杉醇和夫拉平度抗血管生成治療后SKOV-3腫瘤整合素αvβ3表達(dá)具有差異性：紫杉醇治療后整合素αvβ3表達(dá)降低34.2%±5.9%(P0.01),而夫拉平度治療后整合素αvβ3表達(dá)輕度升高8.7%±3.2%(P=0.078)。5、流式細(xì)胞術(shù)分析表明紫杉醇治療對于SKOV-3細(xì)胞表面整合素αvβ3表達(dá)無明顯影響,而夫拉平度治療可上調(diào)SKOV-3細(xì)胞表面整合素αvβ3表達(dá),P0.05。結(jié)論99mTc-3PRGD2在監(jiān)測不同抗腫瘤血管生成藥物治療中具有明顯差異性,因此在應(yīng)用此類探針評價抗血管生成藥物療效時應(yīng)特別慎重。論文創(chuàng)新點1、成功制備了新型聚乙二醇修飾的可靶向腫瘤整合素avβ3表達(dá)顯像的探針18F-FB-NH-PEG4-E[PEG4-c(RGDfK)]2。2、通過MicroPET顯像及生物學(xué)分布研究證實了“二價”新探針18F-RGD2可用于卵巢癌顯像及抗腫瘤新生血管療效監(jiān)測,并初步闡明18F-RGD2卵巢癌顯像及監(jiān)測抗腫瘤新生血管藥物療效的分子機(jī)制。3、首次發(fā)現(xiàn)RGD多肽類探針在監(jiān)測抗腫瘤血管生成治療療效中具有差異性,并初步闡明了其分子機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：卵巢癌 整合素αvβ3 RGD肽 PET探針 抗血管生成療效監(jiān)測
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31;R730.44
【目錄】：

• 中文摘要9-15
• Abstract15-23
• 符號說明23-26
• 第一部分 ~(18)F標(biāo)記新型RGD二聚體（~(18)F-RGD_z)探針構(gòu)建及其在SK0V-3卵巢癌荷瘤鼠靶向顯像中的應(yīng)用研究26-43
• 材料與方法26-30
• 1 實驗材料26
• 2 實驗儀器26-27
• 3 實驗方法27-30
• 3.1 ~(18)F-FB-NH-PEG4-E[PEG_4-c (RGDfK)]_2 制備27
• 3.2 細(xì)胞培養(yǎng)27-28
• 3.3 建立荷瘤鼠模型28
• 3.4 生物學(xué)分布及阻斷實驗28
• 3.5 MicroPET顯像28-29
• 3.6 紫杉醇治療方案29
• 3.7 免疫組織化學(xué)分析29-30
• 3.8 統(tǒng)計學(xué)分析30
• 結(jié)果30-31
• 1 放射性標(biāo)記及穩(wěn)定性30
• 2 生物學(xué)分布及阻斷實驗30
• 3 MicroPET顯像30-31
• 4 紫杉醇治療效應(yīng)31
• 4.1 對腫瘤攝取~(18)F-RGD_2的影響31
• 4.2 對于腫瘤MVD的影響31
• 討論31-37
• 參考文獻(xiàn)37-43
• 第二部分 ~(99m)Tc-3PRGD_2監(jiān)測抗腫瘤血管生成藥物療效的差異性研究43-60
• 材料與方法43-48
• 1 實驗材料43-44
• 2 實驗儀器44
• 3 實驗方法44-48
• 3.1 ~(99m)Tc-3PRGD_2制備44
• 3.2 細(xì)胞培養(yǎng)44-45
• 3.3 建立荷瘤鼠模型45
• 3.4 紫杉醇和夫拉平度治療方案45-46
• 3.5 生物學(xué)分布及阻斷實驗46
• 3.6 免疫組織化學(xué)分析46-47
• 3.7 內(nèi)皮細(xì)胞管型形成實驗47
• 3.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測分析47-48
• 3.9 統(tǒng)計學(xué)分析48
• 結(jié)果48-51
• 1 ~(99m)Tc-3PRGD2放射性標(biāo)記及SKOV-3荷瘤鼠體內(nèi)生物學(xué)分布48
• 2 抗血管生成治療對SKVO-3腫瘤生長及增殖影響48-49
• 3 抗血管生成治療對血管生成影響49-50
• 4 ~(99m)Tc-3PRGO2監(jiān)測抗血管治療巧效50
• 5 紫杉醇和夫拉平度治療對整合素avP3表達(dá)的影響50-51
• 討論51-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 全文小結(jié)60-61
• 論文創(chuàng)新點61-62
• 附圖表62-71
• 致謝71-72
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄72-73
• 己發(fā)表英文論文Ⅰ73-89
• 己發(fā)表英文論文Ⅱ89-113
• 附件113

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 邸麗娟;張旭初;張春麗;王榮福;;RGD肽類腫瘤受體顯像劑的研究進(jìn)展[J];標(biāo)記免疫分析與臨床;2007年01期

  本文關(guān)鍵詞：靶向整合素αvβ3新型探針制備及卵巢癌顯像和抗瘤血管藥效監(jiān)測研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：377218