發(fā)布時間：2018-01-16 04:06

  本文關(guān)鍵詞：α-螺旋型膜活性多肽對模擬膜和生物膜作用機理的研究　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 膜活性多肽 模擬膜 細胞膜 選擇性 原子力顯微鏡 單分子力譜技術(shù)

【摘要】：在臨床治療中,細菌感染一直是備受人們關(guān)注的問題。抗生素的出現(xiàn)有效抑制各種致病細菌、真菌的感染,對保護人類的健康起著重要的作用。但是,抗生素的濫用導(dǎo)致耐藥菌甚至是超級細菌的產(chǎn)生,為人類帶來新的問題。因此,尋找抗生素的合適替代品成為人們研究的熱點。同時,癌癥作為一種常見的惡性疾病,發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢,嚴重威脅著人類的健康和生命。目前臨床使用的抗腫瘤藥物主要是烷基化試劑和抗代謝類藥物,很多藥物不僅利用率低,而且具有很強的毒副作用。因此,尋找新型的抗腫瘤藥物也具有十分重要的意義。膜活性多肽是一類作用于細胞膜的生物活性肽,主要包括抗細菌肽、抗真菌肽和抗癌肽。膜活性多肽以其廣譜性、速效性和不易產(chǎn)生耐藥性等特點而受到人們的廣泛重視。但是,膜活性多肽對細菌和癌細胞作用機理尚無定論。因此,研究膜活性多肽的作用機理具有重要的理論和實際意義。本課題以前期工作獲得的膜活性多肽V13K為母肽,利用氨基酸之間疏水性和電荷不同的性質(zhì),改造設(shè)計兩組具有不同疏水性和電荷性質(zhì)的多肽。首先,通過采用倍比稀釋法檢測多肽對不同的革蘭氏陽性細菌和陰性細菌的抗細菌活性、針對不同的癌細胞的抗癌活性以及針對正常細胞和血紅細胞的毒性,通過構(gòu)效關(guān)系分析得到膜活性多肽的生物活性與多肽的疏水性和電荷密切相關(guān),疏水性越強,其抗細菌和抗癌的能力越強;含有負電荷氨基酸的多肽生物活性相對較弱。同時,實驗證實膜活性多肽對細菌和癌細胞的破壞能力要高于對正常細胞和血紅細胞的破壞能力。其次,通過膜活性多肽對細菌外膜和內(nèi)膜滲透性試驗,和流式細胞儀檢測其對癌細胞膜的破壞作用。結(jié)果證實,膜活性多肽對細菌和癌細胞的細胞膜均具有破壞能力。并且,疏水性越強的多肽對細菌和癌細胞的細胞膜破壞能力越強。此外,含有負電荷氨基酸的膜活性多肽對細菌和癌細胞的細胞膜破壞能力相對較弱,這一結(jié)果與膜活性多肽的生物活性實驗結(jié)果相一致。進一步利用磷脂模擬膜方法,通過色氨酸藍移實驗和碘化鉀淬滅實驗研究膜活性多肽與細胞膜磷脂成分相互作用的過程。結(jié)果證實,疏水性強的多肽與磷脂模擬膜的作用能力強;含有負電荷氨基酸的多肽與磷脂模擬膜的作用能力較弱。此外,我們還發(fā)現(xiàn)含有正電荷的膜活性多肽與含有負電荷的原核細胞模擬膜和癌細胞模擬膜的作用能力相對較強,而多肽與中性的正常細胞模擬膜的作用能力相對較弱。這一結(jié)果與膜活性多肽的生物活性實驗結(jié)果相一致,進一步證明膜活性多肽對細菌細胞膜和癌細胞膜具有選擇性。最后,通過原子力顯微鏡成像技術(shù)和單分子力譜技術(shù),進一步研究膜活性多肽對不同細胞膜作用的機理。其中,原子力顯微鏡成像技術(shù)可以直觀的展現(xiàn)膜活性多肽與細菌和癌細胞相互作用前后的細胞膜表面形貌。原子力顯微鏡單分子力譜技術(shù)研究單分子多肽與不同磷脂模擬膜及其對應(yīng)的生物膜的相互作用力大小。通過對比分析膜活性多肽對不同細胞膜作用的力值大小和作用幾率,證實疏水性越強的多肽與細胞膜作用的能力越強,而含有負電荷氨基酸的多肽作用能力較弱。此外,利用膜活性多肽與原核細胞膜和癌細胞膜的作用能力較強,對正常細胞膜作用能力相對較弱。上述結(jié)果進一步驗證膜活性多肽的靶向性作用機制主要依賴于細胞膜磷脂成分的差異,即含有正電荷的多肽與含有負電荷的原核細胞和癌細胞的細胞膜作用能力更強,這一結(jié)果與前期提出的“膜區(qū)分機理”相一致。膜活性多肽對不同細胞膜作用的靶向特異性,為進一步改造設(shè)計針對細菌和癌細胞靶向治療的膜活性多肽及其臨床應(yīng)用奠定重要的理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:In the clinical treatment of bacterial infections has always been a concern of the people. The emergence of antibiotic effectively suppress various pathogenic bacteria, fungal infection, plays an important role in the protection of human health. However, the abuse of antibiotic resistant bacteria and even lead to the birth of super bacteria, bring new problems for human beings. Therefore, looking for a suitable alternative to antibiotics has become a hot research spot. At the same time, cancer as a common malignant disease, the incidence increasing year by year, a serious threat to human health and life. The current clinical use of anticancer drugs is an alkylating agent and anti metabolic drugs, many drug not only low utilization rate, but also has strong side effects. Therefore, it is very important to find new anticancer drug. The membrane is a kind of bioactive peptides on the cell membrane of biological active peptide, the main To include antibacterial peptide, antifungal peptides and anticancer peptides. Membrane active peptides with broad-spectrum, quick and easy to produce drug resistance and other characteristics have attracted much attention. However, membrane active peptides on the bacterial action and mechanism of cancer cells is inconclusive. Therefore, it has important theoretical and practical significance to study mechanism of the membrane active peptides. Membrane active peptide V13K subject to the preliminary work obtained as the parent peptide, using hydrophobic and different charge properties of amino acids between two groups of polypeptides with different hydrophobicity and charge properties of the design. First, by using twice dilution method on different detection polypeptide of gram positive bacteria and gram negative bacterial anti bacterial activity, according to the different cancer cells and the toxicity of anticancer activity to normal cells and red blood cells, the structure-activity relationship analysis of membrane active peptides with biological activity Peptide hydrophobicity and charge is closely related to the hydrophobic property and the ability of anti bacteria and stronger anticancer bioactive peptide; amino acid containing negative charge is relatively weak. At the same time, experiments confirmed that destruction membrane active peptides on bacteria and cancer cells than in normal cells and destruction of red blood cells. Then the permeability test of bacteria, the outer and inner membrane active peptides by flow cytometry, and the destructive effect on the cancer cell membrane. The results confirmed that the cell membrane active peptides on bacteria and cancer cells have ability to destroy the cell membrane. Moreover, the stronger the water hydrophobic polypeptide on bacteria and cancer cells the destruction of the stronger. In addition, membrane active peptides containing negative charged amino acid on bacteria and cancer cell destruction ability is relatively weak, this result is consistent with the result of biological activity and membrane active peptides. Further The simulation method by using phospholipid membrane, tryptophan blue shift and iodide quenching experiment experimental study of membrane active peptides and cell membrane phospholipid interactions. The results confirmed that the role of peptide and phospholipid analog membrane hydrophobic strong; peptide and phospholipid membranes containing negatively charged amino acid analog function is weak. In addition, we also found that the capacity of membrane active polypeptides containing positive charge and prokaryotic cells containing negative charge simulation film and cancer cell membrane simulation ability is relatively strong, while normal cell peptide and neutral phase of simulation of membrane is weak. This result is consistent with the result of biological activity and membrane active peptides and further proof of membrane active peptides with selective on bacterial cell membrane and cell membrane. Finally, the imaging technique of atomic force microscopy and single molecule force spectroscopy techniques, further research on membrane activity The mechanism of effect of different peptides on the cell membrane. The atomic force microscopy imaging technology can directly show the membrane active peptides with bacteria and cancer cells before and after the interaction of the cell membrane surface morphology. The size of the interaction of atomic force microscope singlemoleculeforcespectroscopy biofilm single molecule polypeptide with different phospholipid membrane and its corresponding simulation technology research through comparing and analyzing the effect of different membrane active peptides on the cell membrane of the magnitude and probability of effect, confirmed the ability of peptide cell membrane effect of the hydrophobic property of the stronger, and with negative charge amino acid polypeptide capability is weak. In addition, the capacity of membrane active peptides and prokaryotic cell membrane and cell membrane strong ability of normal cell membrane is relatively weak. The above results further verify the membrane active peptides targeting mechanism mainly depends on the membrane phospholipid composition difference ISO, which contains a positively charged polypeptide with negative charge of prokaryotic cells and cancer cells the ability of cell membrane is stronger, the results with the previous proposed "film mechanism of distinguishing is consistent. The membrane active peptides on different cell membrane targeting specificity, for further improving the design for bacteria and cancer cell membrane targeting peptide therapy and its clinical application lays an important theoretical basis.

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R91

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本文編號：1431448