本文關(guān)鍵詞：四面體DNA納米結(jié)構(gòu)探針設(shè)計(jì)及其在生物傳感中的應(yīng)用

  更多相關(guān)文章： 四面體DNA納米結(jié)構(gòu) 界面調(diào)控 microRNAs 電子傳遞 循環(huán)腫瘤 細(xì)胞捕獲

【摘要】：本論文主要是設(shè)計(jì)四面體DNA納米結(jié)構(gòu)探針，并將其應(yīng)用于生物傳感。生物分子檢測(cè)的靈敏度不僅由分子之間的親和力決定，還與生物傳感器的界面性質(zhì)相關(guān)。在宏觀(guān)界面，探針數(shù)量多，探針之間相互纏繞，而且傳質(zhì)慢；在微-納米界面，探針傳質(zhì)速度快，但是界面有限，限制了有效的探針數(shù)目。而將四面體DNA納米結(jié)構(gòu)組裝在宏觀(guān)電極表面不僅具有探針數(shù)量多，而且能精確控制探針之間的距離，具有納米探針傳質(zhì)速率快的優(yōu)勢(shì)，提高檢測(cè)靈敏度。此外，四面體DNA納米結(jié)構(gòu)具有一定的厚度，可以提供類(lèi)溶液環(huán)境，提高捕獲探針和靶分子結(jié)合能力。因此，本論文基于四面體DNA納米結(jié)構(gòu)，首先實(shí)現(xiàn)跨尺度界面精確調(diào)控用于超靈敏DNA檢測(cè)、發(fā)展microRNA檢測(cè)的電化學(xué)傳感器、亞甲基藍(lán)電子傳遞研究和循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲，具體如下： 第一，構(gòu)筑有序、可控的生物傳感界面是生物檢測(cè)研究領(lǐng)域的挑戰(zhàn)性問(wèn)題之一。針對(duì)這一問(wèn)題，我們利用DNA納米結(jié)構(gòu)精確可控特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一系列不同尺寸的DNA四面體納米結(jié)構(gòu)，并利用這些結(jié)構(gòu)在金界面的有序組裝發(fā)展一種“軟光刻”技術(shù)。這種跨尺度精確調(diào)控技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)在宏觀(guān)的金界面上構(gòu)筑納米尺度可控的框架結(jié)構(gòu)，精確調(diào)控依托于這些結(jié)構(gòu)上的DNA探針之間的距離。同時(shí)，系統(tǒng)地研究DNA分子之間的納米距離與生物傳感性能之間的關(guān)系，，并提高界面生物分子識(shí)別的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)過(guò)程，從而顯著性提高電化學(xué)生物傳感器的檢測(cè)靈敏度和速度。 第二，發(fā)展了基于靶標(biāo)響應(yīng)、四面體DNA納米結(jié)構(gòu)的E-DNA傳感器用于microRNA檢測(cè)。microRNA調(diào)控許多細(xì)胞內(nèi)過(guò)程，成為重要的腫瘤標(biāo)志物之一，但是microRNA序列短、含量低，難以發(fā)展快速、廉價(jià)、簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法。四面體DNA納米結(jié)構(gòu)很好控制莖環(huán)結(jié)構(gòu)的密度，提高反應(yīng)活性，能夠特異性檢測(cè)低至1fM的microRNA-141。 第三，聯(lián)合四面體DNA納米結(jié)構(gòu)探針和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）放大，實(shí)現(xiàn)超靈敏的microRNA檢測(cè)，可以分別檢測(cè)100aM、10aM的DNA和microRNA，靈敏度比超級(jí)夾心法至少提高3個(gè)數(shù)量級(jí)，比第三代E-DNA傳感器提高100倍。 第四，四面體構(gòu)型的穩(wěn)定性和剛性保證了探針的取向、探針間的距離，避免探針互相纏繞，可以精確研究亞甲基藍(lán)（MB）在不同位置的電子傳遞。首次提出MB在nick處不嵌入雙鏈π-堆積的堿基對(duì)中而阻礙了MB的電子傳遞，具有應(yīng)用于分子開(kāi)關(guān)的潛能。利用MB分子在兩種堿基環(huán)境中信號(hào)差異，設(shè)計(jì)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的基因傳感器，對(duì)靶序列有正響應(yīng)，即signal-on傳感器，可以避免假陽(yáng)性產(chǎn)生。并且這種傳感器只要一步合成，簡(jiǎn)單、方便，能夠靈敏地區(qū)分單堿基錯(cuò)配。 最后，利用四面體DNA納米結(jié)構(gòu)作為剛性支架，可控連接多個(gè)EpCAM的aptamer SYL3C，用于增強(qiáng)捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）。通過(guò)改變四面體DNA納米結(jié)構(gòu)的大小，控制aptamer之間的距離；通過(guò)控制四面體延伸鏈的方向和個(gè)數(shù)，可以控制aptamer的取向和價(jià)數(shù)。組裝在四面體納米結(jié)構(gòu)上的aptamer保持特異性結(jié)合CTCs的特點(diǎn)，并且三價(jià)aptamer納米結(jié)構(gòu)比單價(jià)aptamer結(jié)合細(xì)胞有更強(qiáng)的親和力，和更高的捕獲效率。這種基于DNA納米結(jié)構(gòu)捕獲細(xì)胞的方法，具有生物兼容性，對(duì)細(xì)胞損傷小，分離后的細(xì)胞存活率超過(guò)85%，保持細(xì)胞膜完整，可直接用于細(xì)胞培養(yǎng)，并且培養(yǎng)的細(xì)胞具有增殖能力，保持正常水平的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)。另外，這種多價(jià)aptamer四面體DNA納米結(jié)構(gòu)可以有效分離混合體系、全血里少量的（100個(gè)及以下）MCF7，捕獲效率超過(guò)70%，比單價(jià)aptamer捕獲效率高20%以上，而且還可以應(yīng)用于乳腺癌患者全血中CTCs的檢測(cè)。
【關(guān)鍵詞】：四面體DNA納米結(jié)構(gòu) 界面調(diào)控 microRNAs 電子傳遞 循環(huán)腫瘤 細(xì)胞捕獲
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院研究生院（上海應(yīng)用物理研究所）
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：O657.1;TP212
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 目錄10-13
• 第一章 緒論13-37
• 1.1 一維 DNA 納米線(xiàn)在生物傳感中的應(yīng)用15-19
• 1.1.1 滾環(huán)放大法15-18
• 1.1.2 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大法18-19
• 1.2 二維 DNA 納米結(jié)構(gòu)在生物傳感中的應(yīng)用19-22
• 1.2.1 基于 DNA tile 結(jié)構(gòu)的分子檢測(cè)19-20
• 1.2.2 基于 DNA origami 的分子檢測(cè)20-22
• 1.3 三維 DNA 納米結(jié)構(gòu)在生物傳感中的應(yīng)用22-25
• 1.3.1 基于 DNA 水凝膠的分子檢測(cè)22-23
• 1.3.2 基于四面體 DNA 納米結(jié)構(gòu)的分子檢測(cè)23-25
• 1.4 本課題的設(shè)計(jì)25-29
• 參考文獻(xiàn)29-37
• 第二章 利用 DNA 納米結(jié)構(gòu)構(gòu)筑有序、可控生物傳感界面用于超靈敏 DNA 檢測(cè)37-75
• 2.1 引言37-38
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分38-46
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器38-42
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟42-46
• 2.3 結(jié)果與討論46-68
• 2.3.1 四面體 DNA 納米結(jié)構(gòu)形成表征46-50
• 2.3.2 四面體 DNA 納米結(jié)構(gòu)在電極表面的組裝、密度測(cè)定50-58
• 2.3.3 四面體 DNA 納米結(jié)構(gòu)在電極表面雜交動(dòng)力學(xué)和雜交效率的研究58-60
• 2.3.4 四面體 DNA 納米結(jié)構(gòu)調(diào)控 DNA 生物傳感器60-68
• 2.4 結(jié)論68-70
• 參考文獻(xiàn)70-75
• 第三章 構(gòu)建基于目標(biāo)響應(yīng)、四面體 DNA 納米結(jié)構(gòu)的 E-DNA 傳感器用于 microRNA檢測(cè)75-91
• 3.1 引言75-77
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分77-80
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器77-79
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟79-80
• 3.3 結(jié)果與討論80-86
• 3.3.1 第三代 E-DNA 傳感器檢測(cè) microRNA 的電化學(xué)表征80-81
• 3.3.2 反應(yīng)溫度的優(yōu)化81-82
• 3.3.3 莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖長(zhǎng)度的優(yōu)化82-84
• 3.3.4 第三代 E-DNA 傳感器用于 microRNA141 的靈敏性和特異性測(cè)定84-85
• 3.3.5 第三代 E-DNA 傳感器檢測(cè) microRNA 通用性驗(yàn)證85-86
• 3.4 結(jié)論86-87
• 參考文獻(xiàn)87-91
• 第四章 聯(lián)合四面體 DNA 納米結(jié)構(gòu)和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)現(xiàn)超靈敏 MicroRNA 檢測(cè)91-113
• 4.1 引言91-94
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分94-99
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器94-96
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟96-99
• 4.3 結(jié)果與討論99-106
• 4.3.1 四面體 DNA 納米結(jié)構(gòu)形成表征99-100
• 4.3.2 溶液中雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的驗(yàn)證以及與超級(jí)夾心結(jié)構(gòu)的比較100-102
• 4.3.3 QCM 驗(yàn)證金表面上 HCR 反應(yīng)的發(fā)生102-103
• 4.3.4 聯(lián)合四面體 DNA 納米探針和 HCR 構(gòu)建 DNA 電化學(xué)傳感器103-104
• 4.3.5 聯(lián)合四面體 DNA 納米探針和 HCR 構(gòu)建 microRNA 電化學(xué)傳感器104-106
• 4.4 結(jié)論106-107
• 參考文獻(xiàn)107-113
• 第五章 基于四面體 DNA 納米結(jié)構(gòu)的亞甲基藍(lán)電子傳遞的研究113-137
• 5.1 引言113-115
• 5.2 實(shí)驗(yàn)部115-119
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器115-117
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟117-119
• 5.3 結(jié)果與討論119-132
• 5.3.1 MB 在雙鏈兩端的電子傳遞研究119-121
• 5.3.2 MB 在四面體 DNA 納米結(jié)構(gòu)頂端延伸雙鏈兩端的電子傳遞研究121-123
• 5.3.3 基于 MB 分子在四面體 DNA 納米結(jié)構(gòu)頂端雙鏈位置不同信號(hào)差異設(shè)計(jì)電化學(xué)傳感器用于單堿基錯(cuò)配分析123-126
• 5.3.4 計(jì)算 MB 分子在不同莖環(huán)結(jié)構(gòu)以及加了完全互補(bǔ)序列、單堿基錯(cuò)配序列的電子傳遞速率常數(shù)126-129
• 5.3.5 研究 MB 分子電子傳遞機(jī)制129-131
• 5.3.6 基于 MB 在四面體頂端莖環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)靶分子響應(yīng)設(shè)計(jì) signal-on 基因傳感器131-132
• 5.4 結(jié)論132-134
• 參考文獻(xiàn)134-137
• 第六章 四面體 DNA 納米結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的可控、多價(jià) aptamer 用于增強(qiáng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲137-159
• 6.1 引言137-139
• 6.2 實(shí)驗(yàn)部分139-144
• 6.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器139-142
• 6.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟142-144
• 6.3 結(jié)果與討論144-154
• 6.3.1 多價(jià) aptamer 四面體 DNA 納米結(jié)構(gòu)的形成及其特異性結(jié)合 CTCs144-148
• 6.3.2 不同價(jià)態(tài) aptamer 與細(xì)胞結(jié)合能力的比較148-149
• 6.3.3 多價(jià) aptamer 可有效捕獲細(xì)胞149-150
• 6.3.4 分離后細(xì)胞存活度和 RT-PCR 分析150-152
• 6.3.5 在模擬樣本和乳腺癌患者全血中的 CTCs 捕獲152-154
• 6.4 結(jié)論154-155
• 參考文獻(xiàn)155-159
• 第七章 總結(jié)與展望159-161
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文161-163
• 致謝163-165

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 仰大勇;許傳營(yíng);彭松明;崔金輝;俞雁;韓偉;崔海信;羅丹;;DNA水凝膠分子設(shè)計(jì)、合成與應(yīng)用[J];科學(xué)通報(bào);2014年02期

2 ;Electrochemical single nucleotide polymorphisms genotyping on surface immobilized three-dimensional branched DNA nanostructure[J];Science China(Chemistry);2011年08期

本文編號(hào)：728035