本文關鍵詞：快速特異檢測大腸桿菌O157:H7的B細胞生物傳感器研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：微生物污染引起的食物中毒是國內外食品安全領域中的主要問題,目前急需發(fā)展一個新型、快速、特異和靈敏的檢測食品中致病菌的方法。本課題結合細胞生物學、免疫學、光學等技術領域的最新成果,以大腸桿菌0157:H7(Escherichiacoli O157：H7)為模式菌,探討了以B細胞作為生物傳感器受體元件檢測食源性致病菌的可能性,并研究了兩種基于B細胞的生物傳感器技術。1.E.coli O157：H7和B細胞的相互作用研究了特異性表達抗E.coli O157的IgM的B細胞作為生物傳感器中識別元件的生長特性和I gM的活性。用流式細胞術研究B細胞捕獲不同濃度E.coli0157：H7的情況,以及B細胞與E.coli O157：H7孵育不同時間后的活力。結果顯示,該B細胞具有I gM活性,當與E.coli O157：H7孵育1小時,不同濃度細菌對B細胞活力均無影響;表明該B細胞可以作為生物傳感器中的生物識別元件用于構建基于細胞的生物傳感器進行食源性大腸桿菌檢測。2.基于化學鈣離子指示劑B細胞生物傳感器的構建該試驗目的是開發(fā)一個基于化學鈣離子指示劑的B細胞生物傳感器。當加載了Fura-2的B細胞與菌體接觸后,B細胞受體(B cell receptor, BCR)介導的鈣離子信號通路被激活,由此導致胞質內鈣離子濃度在數秒內升高,高濃度鈣離子與Fura-2進行結合從而導致其熒光信號的改變以報道靶標致病菌的存在。本試驗中的B細胞生物傳感器在30μL體系中,可以檢測E. coli 0157:H7的菌體數量低至18個細胞,檢測范圍為102至105 CFU/mL,檢測時間從樣品準備到檢測可在10 min左右完成。最后,用該B細胞生物傳感器對非靶標致病菌和食品樣品中的E. coli 0157:H7進行了檢測,發(fā)現該傳感器顯示出了優(yōu)良的特異性。3.基于遺傳工程鈣離子指示劑B細胞生物傳感器的構建在該試驗中,使用一個遺傳編碼的鈣離子指示劑(genetically encoded Ca2+ indicators,GECI)作為報告子,構建了一個基于熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的B細胞生物傳感器。當E. coli 0157:H7與B細胞膜表面的IgM結合時會激活BCR介導的鈣離子信號通路,導致胞內鈣離子濃度的瞬時增強,繼而觸發(fā)GECI TN-XXL的FRET發(fā)生以報告致病菌的存在。結果證實TN-XXL和基于FRET的方法構建出的B細胞生物傳感器用于檢測靶標致病菌具有高靈敏性,并可以在10 min內完成檢測并無需樣品的前富集。這可以構建一個通過觀測BCR激活而用于檢測致病菌存在的通用方法,可用于檢測對B細胞有特異性的致病菌。這兩種技術可以實現對大腸桿菌0157：H7快速、靈敏和特異的檢測,為今后細胞生物傳感器用于食品中大腸桿菌或其他重要食源性致病菌的快速檢測奠定了工作基礎。
【關鍵詞】：E.coli 0157:H7 B細胞 生物傳感器 鈣離子指示劑 FRET
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TP212
【目錄】：

• 致謝7-9
• 摘要9-11
• Abstract11-18
• 主要符號列表18-22
• 1. 緒論22-50
• 1.1 食源性致病菌22-26
• 1.2 生物傳感器26-39
• 1.2.1 檢測致病菌的不同方法26-29
• 1.2.2 生物傳感器29-39
• 1.3 基于細胞的生物傳感器39-46
• 1.3.1 基于哺乳動物細胞的檢測系統(tǒng)39-40
• 1.3.2 基于細胞檢測食源性致病菌40-44
• 1.3.3 CBBs的局限性44-46
• 1.4 本文研究對象與內容46-50
• 1.4.1 研究對象46-47
• 1.4.2 研究內容47-48
• 1.4.3 研究目標48
• 1.4.4 技術路線48-50
• 2. B細胞和B. coli O157：H7的相互作用50-66
• 2.1 引言50-51
• 2.2 材料和方法51-55
• 2.2.1 試驗試劑51-52
• 2.2.2 細胞培養(yǎng)和生長曲線52
• 2.2.3 細菌菌株和培養(yǎng)條件52-53
• 2.2.4 ELISA53
• 2.2.5 B細胞對細菌捕獲53
• 2.2.6 細菌對B細胞凋亡的影響53-54
• 2.2.7 統(tǒng)計學分析54-55
• 2.3 結果55-62
• 2.3.1 B細胞的生長55
• 2.3.2 ELISA55-56
• 2.3.3 B細胞對細菌的捕獲56-58
• 2.3.4 細菌對B細胞凋亡的影響58-62
• 2.4 討論62-64
• 2.5 結論64-66
• 3. 基于化學鈣離子指示劑的B細胞生物傳感器構建66-86
• 3.1 引言66-70
• 3.2 材料和方法70-74
• 3.2.1 試驗試劑70
• 3.2.2 細胞培養(yǎng)條件70-71
• 3.2.3 細菌菌株和培養(yǎng)條件71-72
• 3.2.4 掃描電鏡成像72
• 3.2.5 B細胞生物傳感器的制備72
• 3.2.6 純培養(yǎng)物中E.coli O157：H7的檢測72-73
• 3.2.7 牛肉樣品中E.coli O157：H7的檢測73
• 3.2.8 統(tǒng)計學分析73-74
• 3.3 結果74-82
• 3.3.1 B細胞生物傳感器的優(yōu)化74-76
• 3.3.2 純培養(yǎng)物中E.coli O157：H7的檢測76-80
• 3.3.3 食品樣品中E.coli O157：H7的檢測80-82
• 3.4 討論82-85
• 3.5 結論85-86
• 4 基于遺傳工程鈣離子指示劑的B細胞生物傳感器構建86-104
• 4.1 引言86-89
• 4.2 材料和方法89-93
• 4.2.1 試驗試劑89-90
• 4.2.2 細胞培養(yǎng)和轉染條件90
• 4.2.3 細菌菌株和培養(yǎng)條件90-91
• 4.2.4 掃描電鏡成像91
• 4.2.5 FRET試驗91-92
• 4.2.6 細菌的檢測92
• 4.2.7 統(tǒng)計學分析92-93
• 4.3 結果93-99
• 4.3.1 質粒的驗證與轉染93-94
• 4.3.2 B細胞和細菌的相互作用的掃描電鏡成像94-95
• 4.3.3 受體光漂白技術對FRET的研究95-97
• 4.3.4 細菌的檢測97-99
• 4.4 討論99-102
• 4.5 結論102-104
• 5. 結論與展望104-108
• 5.1 研究結論104-105
• 5.2 創(chuàng)新點105
• 5.3 展望105-108
• 參考文獻108-120
• 作者簡介120-12

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