發(fā)布時(shí)間：2017-05-02 12:07

  本文關(guān)鍵詞：心肌細(xì)胞阻抗和電位傳感器在離子通道類海洋毒素檢測(cè)中的應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：隨著現(xiàn)代化工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展,海洋生物毒素已經(jīng)嚴(yán)重威脅到全人類的生命健康,尤其是離子通道類海洋毒素。它們占了總毒素的80%以上,是海洋生物毒素中分布最廣危害最大的一類毒素,很可能會(huì)引發(fā)某些離子通道類疾病。傳統(tǒng)的小鼠生物法為標(biāo)準(zhǔn)的毒素檢測(cè)法,但因其種種局限(例如靈敏度低、重復(fù)性差等),已難以滿足海洋毒素日常監(jiān)測(cè)的需要。常規(guī)的基于化學(xué)結(jié)構(gòu)的高效液相色譜分析法(HPLC),因其設(shè)備昂貴和技術(shù)復(fù)雜也難以完全取代小鼠生物法。近年來(lái),一些基于功能活性的細(xì)胞檢測(cè)法陸續(xù)發(fā)展起來(lái),但傳統(tǒng)的細(xì)胞檢測(cè)手段較耗時(shí)且不能實(shí)時(shí)反映細(xì)胞的動(dòng)態(tài)信息。細(xì)胞傳感器作為一種新型的功能性細(xì)胞檢測(cè)法,因其無(wú)損、高靈敏、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)而備受?chē)?guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注。目前,細(xì)胞傳感器在海洋毒素研究中的應(yīng)用還為數(shù)不多,它結(jié)合了細(xì)胞檢測(cè)和生物傳感器的各自優(yōu)點(diǎn),是一項(xiàng)十分有前景的毒素檢測(cè)技術(shù)。本文選擇穩(wěn)態(tài)性和魯棒性強(qiáng)的電興奮心肌細(xì)胞作為敏感元件,旨在構(gòu)建高性能心肌細(xì)胞阻抗和電位傳感器,并將其應(yīng)用于離子通道類海洋毒素的檢測(cè)分析。本論文的主要?jiǎng)?chuàng)新性的工作在于：1.設(shè)計(jì)了高通量和多通道細(xì)胞電位傳感器系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了心肌細(xì)胞胞外場(chǎng)電位的高通量和多通道檢測(cè)本文設(shè)計(jì)了兩種細(xì)胞電位傳感器芯片：?jiǎn)慰?2通道微電極陣列(MEA)芯片和高通量16孔64通道MEA芯片。同時(shí)針對(duì)這兩種MEA芯片開(kāi)發(fā)了3種細(xì)胞電位傳感器系統(tǒng)：?jiǎn)慰?2通道細(xì)胞電位傳感器、單孔8通道無(wú)線細(xì)胞電位傳感器、高通量細(xì)胞電位傳感器。最后通過(guò)心肌細(xì)胞胞外場(chǎng)電位實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了三者均具備良好的胞外場(chǎng)電位檢測(cè)功能。兩種單孔多通道細(xì)胞電位傳感器實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)胞外場(chǎng)電位(EFP)的多位點(diǎn)檢測(cè)。相比于單孔32通道細(xì)胞電位傳感器,8通道無(wú)線細(xì)胞電位傳感器在外型上實(shí)現(xiàn)了便攜式小型化,更方便于EFP檢測(cè)。高通量細(xì)胞電位傳感器在單孔細(xì)胞電位傳感器的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了多個(gè)細(xì)胞樣本EFP的同步檢測(cè),大大提高了檢測(cè)效率。2.深入研究了促進(jìn)心肌細(xì)胞與傳感器芯片耦合的改進(jìn)方法,并成功構(gòu)建了高度穩(wěn)定性和一致性的心肌細(xì)胞阻抗和電位傳感器本文深入研究了芯片表面蛋白修飾法和優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)密度法對(duì)心肌細(xì)胞和傳感器芯片耦合的促進(jìn)作用。研究結(jié)果表明,對(duì)于細(xì)胞阻抗傳感器(ECIS)芯片而言,心肌細(xì)胞按優(yōu)化密度12k/well(8.5萬(wàn)/cm2)培養(yǎng)在經(jīng)高分子蛋白明膠修飾的96孔ECIS培養(yǎng)板上,可促使心肌細(xì)胞和ECIS芯片形成高度緊密的耦合。在此條件下構(gòu)建的高通量心肌細(xì)胞阻抗傳感器,能穩(wěn)定輸出一致性良好的搏動(dòng)信號(hào)(搏動(dòng)幅值：0.045-0.05；搏動(dòng)頻率：90-105次/min),信號(hào)穩(wěn)定期(毒素干預(yù)的最佳時(shí)期)可以維持32h；對(duì)于MEA芯片而言,研究結(jié)果表明了心肌細(xì)胞按優(yōu)化密度12萬(wàn)/cm2培養(yǎng)在經(jīng)明膠修飾的單孔MEA芯片上,可促使心肌細(xì)胞和MEA芯片形成高度緊密的耦合。在此條件下構(gòu)建的單孔8通道無(wú)線心肌細(xì)胞電位傳感器,能穩(wěn)定輸出一致性良好的胞外場(chǎng)電位(EFP)信號(hào)(峰電位幅值：16-1.8 mv；發(fā)放頻率：150-180次/min),信號(hào)穩(wěn)定期可以維持60 h。本文同時(shí)選了兩種典型的工具藥物異丙腎上腺素和利多卡因?qū)?yōu)化后的兩種高性能心肌細(xì)胞傳感器進(jìn)行了分析性能的測(cè)試,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了心肌細(xì)胞阻抗和電位傳感器均對(duì)測(cè)試藥物做出了正確而靈敏的響應(yīng),具備良好的檢測(cè)分析功能。3.提出了高通量檢測(cè)石房蛤毒素(STX)、河豚毒素(TTX)的心肌細(xì)胞阻抗傳感器檢測(cè)方法本文將優(yōu)化后的高通量心肌細(xì)胞阻抗傳感器應(yīng)用于離子通道類海洋毒素的毒性評(píng)價(jià),提出了一種新型高通量的離子通道類海洋毒素功能性檢測(cè)法。我們主要研究了3種具有代表性的離子通道類海洋毒素(STX、TTX、PbTx-2)的毒性作用。通過(guò)分析毒素作用24 h后心肌細(xì)胞阻抗傳感器的信號(hào)特征參數(shù)(細(xì)胞指數(shù)CI、搏動(dòng)幅值BA、搏動(dòng)頻率BR)的變化,得出該阻抗傳感器對(duì)PbTx-2的敏感性較差,對(duì)高濃度(4μM,3.6 ppm)的PbTx-2沒(méi)有響應(yīng)；對(duì)STX的敏感參數(shù)為BR,檢出限為0.09 ng/mL,檢測(cè)范圍為0.25～20 nM和0.18-14.6μM；對(duì)TTX的敏感參數(shù)為BR,檢出限為89 ng/mL,檢測(cè)范圍為0.4～20μM。該阻抗傳感器實(shí)現(xiàn)了STX高通量高靈敏檢測(cè)。心肌細(xì)胞電位傳感器法具有通量高、檢出限低、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),有望成為新型高通量的離子通道類海洋毒素檢測(cè)平臺(tái)。4.提出了快速檢測(cè)石房蛤毒素(STX)、河豚毒素(TTX)和短裸甲藻毒素(PbTx-2)的心肌細(xì)胞電位傳感器檢測(cè)法基于心肌細(xì)胞阻抗傳感器檢測(cè)法的研究基礎(chǔ),本文將優(yōu)化后的單孔8通道無(wú)線心肌細(xì)胞電位傳感器應(yīng)用于離子通道類海洋毒素的毒性評(píng)價(jià),提出了一種新型快速的離子通道類海洋毒素功能性檢測(cè)法。我們同樣選擇STX、TTX、 PbTx-2作為研究對(duì)象,通過(guò)分析毒素作用5 min后心肌細(xì)胞電位傳感器EFP信號(hào)特征參數(shù)(峰電位幅值SA、發(fā)放頻率FR、峰電位半時(shí)程SPD50)的變化,得出該電位傳感器對(duì)STX和PbTx-2的敏感參數(shù)分別為FR和SPDso,檢出限分別為0.35 ng/mL和1.55 ng/mL檢測(cè)范圍均為1.56～400 nM；對(duì)TTX的敏感參數(shù)為FR,檢出限分別為83 ng/mL,檢測(cè)范圍為400～3200 nM。該電位傳感器實(shí)現(xiàn)了STX和PbTx-2的快速高靈敏檢測(cè)。心肌細(xì)胞電位傳感器法具有簡(jiǎn)便快速、檢出限低、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),有望成為新型快速的離子通道類海洋毒素檢測(cè)平臺(tái)。
【關(guān)鍵詞】：心肌細(xì)胞阻抗傳感器 心肌細(xì)胞電位傳感器 石房蛤毒素(STX) 河豚毒素(TTX) 短裸甲藻毒素(PbTx-2) 細(xì)胞阻抗信號(hào) 胞外場(chǎng)電位信號(hào)
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TP212;R99
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-16
• 第一章 緒論16-32
• 1.1 海洋生物毒素概述16-17
• 1.2 離子通道類海洋毒素17-23
• 1.2.1 離子通道類海洋毒素簡(jiǎn)介17
• 1.2.2 離子通道類海洋毒素的種類17-21
• 1.2.3 離子通道類海洋毒素的作用機(jī)制21-23
• 1.3 離子通道類海洋毒素的現(xiàn)有檢測(cè)方法23-27
• 1.3.1 傳統(tǒng)小鼠生物法24
• 1.3.2 基于化學(xué)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)法24-26
• 1.3.3 基于功能活性的檢測(cè)法26-27
• 1.4 細(xì)胞傳感器在離子通道類海洋毒素檢測(cè)中的應(yīng)用27-29
• 1.5 論文的主要研究?jī)?nèi)容29-32
• 第二章 心肌細(xì)胞阻抗和電位傳感器理論基礎(chǔ)32-48
• 2.1 細(xì)胞傳感器原理32-33
• 2.2 細(xì)胞敏感元件的選擇33-37
• 2.2.1 神經(jīng)元和心肌細(xì)胞對(duì)毒素敏感性的比較33-34
• 2.2.2 細(xì)胞阻抗傳感器敏感元件的選擇34
• 2.2.3 細(xì)胞電位傳感器敏感元件的選擇34-37
• 2.3 心肌細(xì)胞的生理特性37-41
• 2.3.1 心肌細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)37-38
• 2.3.2 心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位及其形成機(jī)制38-39
• 2.3.3 心肌細(xì)胞的興奮-收縮偶聯(lián)機(jī)制39-41
• 2.4 心肌細(xì)胞阻抗傳感器機(jī)理41-44
• 2.4.1 細(xì)胞阻抗傳感器基本模型41-42
• 2.4.2 心肌細(xì)胞生長(zhǎng)和搏動(dòng)檢測(cè)原理42-44
• 2.5 心肌細(xì)胞電位傳感器機(jī)理44-47
• 2.5.1 心肌細(xì)胞動(dòng)作電位H-H模型44-45
• 2.5.2 心肌細(xì)胞電位傳感器模型45-47
• 2.5.3 心肌細(xì)胞胞外場(chǎng)電位檢測(cè)原理47
• 2.6 本章小結(jié)47-48
• 第三章 高通量和多通道細(xì)胞電位傳感器系統(tǒng)的設(shè)計(jì)48-66
• 3.1 細(xì)胞電位傳感器的研究背景48-49
• 3.2 細(xì)胞電位傳感器芯片的設(shè)計(jì)49-56
• 3.2.1 單孔32通道MEA芯片的設(shè)計(jì)與加工49-54
• 3.2.2 高通量MEA芯片的設(shè)計(jì)與加工54-55
• 3.2.3 傳感器芯片的清洗與保存55-56
• 3.3 細(xì)胞電位傳感器系統(tǒng)設(shè)計(jì)56-65
• 3.3.1 單孔32通道細(xì)胞電位傳感器系統(tǒng)56-57
• 3.3.2 單孔8通道無(wú)線細(xì)胞電位傳感器系統(tǒng)57-58
• 3.3.3 高通量細(xì)胞電位傳感器系統(tǒng)58-59
• 3.3.4 細(xì)胞電位傳感器系統(tǒng)基本性能測(cè)試59-60
• 3.3.5 心肌細(xì)胞胞外場(chǎng)電位檢測(cè)60-65
• 3.4 本章小結(jié)65-66
• 第四章 心肌細(xì)胞阻抗和電位傳感器的性能優(yōu)化及其分析性能測(cè)試66-94
• 4.1 引言66-70
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法70-72
• 4.2.1 試劑與耗材70
• 4.2.2 心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)70-71
• 4.2.3 傳感器芯片蛋白修飾實(shí)驗(yàn)71
• 4.2.4 心肌細(xì)胞密度實(shí)驗(yàn)71-72
• 4.2.5 心肌細(xì)胞傳感器藥物測(cè)試實(shí)驗(yàn)72
• 4.3 心肌細(xì)胞阻抗傳感器的性能優(yōu)化72-81
• 4.3.1 心肌細(xì)胞阻抗傳感器的構(gòu)建72-74
• 4.3.2 蛋白修飾對(duì)心肌細(xì)胞和ECIS芯片耦合的影響74-75
• 4.3.3 細(xì)胞密度對(duì)心肌細(xì)胞和阻抗芯片耦合的影響75-78
• 4.3.4 心肌細(xì)胞阻抗傳感器的藥物測(cè)試78-81
• 4.4 心肌細(xì)胞電位傳感器的性能優(yōu)化81-92
• 4.4.1 心肌細(xì)胞電位傳感器的構(gòu)建81
• 4.4.2 蛋白修飾對(duì)心肌細(xì)胞和MEA芯片耦合的影響81-83
• 4.4.3 細(xì)胞密度對(duì)心肌細(xì)胞和MEA芯片耦合的影響83-86
• 4.4.4 EFP信號(hào)模式分析86-89
• 4.4.5 心肌細(xì)胞細(xì)胞電位傳感器的藥物測(cè)試89-92
• 4.5 本章小結(jié)92-94
• 第五章 心肌細(xì)胞阻抗傳感器應(yīng)用于離子通道類海洋毒素的分析94-110
• 5.1 引言94-95
• 5.2 心肌細(xì)胞阻抗傳感器檢測(cè)方法95-97
• 5.2.1 毒素檢測(cè)原理95
• 5.2.2 毒素樣品準(zhǔn)備95-96
• 5.2.3 毒素檢測(cè)流程96-97
• 5.2.4 數(shù)據(jù)分析97
• 5.3 離子通道類海洋毒素的毒性評(píng)價(jià)97-108
• 5.3.1 石房蛤毒素(STX)檢測(cè)分析97-100
• 5.3.2 河豚毒素(TTX)檢測(cè)分析100-103
• 5.3.3 短裸甲藻毒素(PbTx-2)檢測(cè)分析103-105
• 5.3.4 貝肉實(shí)際樣品的檢測(cè)105-106
• 5.3.5 結(jié)果討論與分析106-108
• 5.4 本章小結(jié)108-110
• 第六章 心肌細(xì)胞電位傳感器應(yīng)用于離子通道類海洋毒素的分析110-130
• 6.1 引言110-111
• 6.2 心肌細(xì)胞電位傳感器檢測(cè)方法111-113
• 6.2.1 毒素檢測(cè)原理111
• 6.2.2 毒素樣品準(zhǔn)備111-112
• 6.2.3 毒素檢測(cè)流程112
• 6.2.4 數(shù)據(jù)分析112-113
• 6.3 離子通道類海洋毒素的毒性評(píng)價(jià)113-124
• 6.3.1 石房蛤毒素(STX)的檢測(cè)分析113-116
• 6.3.2 河豚毒素(TTX)檢測(cè)分析116-118
• 6.3.3 短裸甲藻毒素(PbTx-2)檢測(cè)分析118-121
• 6.3.4 貝肉實(shí)際樣品檢測(cè)121-122
• 6.3.5 結(jié)果討論與分析122-124
• 6.4 心肌細(xì)胞電位傳感器法與其他生物檢測(cè)法的比較124-128
• 6.4.1 小鼠生物法檢測(cè)STX毒素124-125
• 6.4.2 熒光成像法檢測(cè)STX毒素125-128
• 6.4.3 結(jié)果討論與分析128
• 6.5 本章小結(jié)128-130
• 第七章 總結(jié)與展望130-134
• 7.1 全文總結(jié)130-132
• 7.2 工作展望132-134
• 參考文獻(xiàn)134-146
• 作者簡(jiǎn)歷146-148
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及成果148-150
• 致謝150

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：340911