本文關(guān)鍵詞：熒光氧氣納米傳感器的構(gòu)建及在腫瘤細(xì)胞線粒體功能障礙評估中的應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《北京交通大學(xué)》 2015年

熒光氧氣納米傳感器的構(gòu)建及在腫瘤細(xì)胞線粒體功能障礙評估中的應(yīng)用

王小卉  

【摘要】：氧含量的檢測在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域有著非常重要的意義,熒光氧氣納米傳感器常被用于檢測細(xì)胞或組織的溶氧量。線粒體是有氧呼吸的主要場所,其代謝損傷會導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生,基于溶氧量的檢測可表征線粒體的呼吸速率,進(jìn)而評估腫瘤細(xì)胞線粒體的功能狀態(tài)。然而,當(dāng)前的傳感器主要針對細(xì)胞外或者細(xì)胞內(nèi)的溶解氧檢測,難以精確測定線粒體內(nèi)的氧含量變化。本論文主要研究生物兼容高靈敏度熒光氧氣納米傳感器的構(gòu)建,并通過對線粒體呼吸速率的熒光檢測,評估腫瘤細(xì)胞線粒體功能障礙。 本論文的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下： 1、利用再沉淀-包覆法制備摻雜氧氣熒光探針分子和參比物質(zhì)的比率熒光氧氣納米傳感器,通過多聚賴氨酸大分子(PLL)的表面修飾使納米傳感器具有較低的毒性和有效的細(xì)胞攝取率。首先以PMMA和BTD為基質(zhì)將疏水性的氧氣探針分子PtOEP和熒光參比分子C6封裝到納米顆粒內(nèi),隨后利用納米顆粒表面硅醇的負(fù)電性和PLL分子的正電性之間的靜電吸引,制備PLL包覆的PtOEP/C6摻雜的PMMA基質(zhì)熒光氧氣納米傳感器。該熒光氧氣納米傳感器的氧氣猝滅率為77%,可通過非線性Stem-Volmer公式進(jìn)行擬合,由于PLL的修飾使其具有良好的生物相容性和較高的細(xì)胞攝取率。在此基礎(chǔ)上,我們利用PS代替PMMA,并且將可以進(jìn)行能量傳遞的熒光團(tuán)DNM與PtOEP、 C6同時封裝到PS基質(zhì)納米顆粒內(nèi),制備了PLL包覆的PtOEP/DNM/C6摻雜的PS基質(zhì)熒光氧氣納米傳感器。該納米傳感器的氧氣猝滅率達(dá)到94%,其比率熒光與溶氧量之間具有良好的線性關(guān)系,并且可以被細(xì)胞有效吞噬,在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)良好的比率熒光成像。 2、通過碳二亞胺反應(yīng)在PLL包覆氧氣納米傳感器表面修飾親脂性陽離子TPP,實現(xiàn)了對細(xì)胞線粒體的靶向定位。首先研究了PLL包覆納米顆粒的自組裝形成機(jī)理,認(rèn)為采用10mg/L的MH-PLL (Mw=30-70kDa)包覆制成的納米顆粒具有最佳的形貌、大小和zeta電勢�；趜eta電勢方法和熒光胺方法對納米顆粒進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)PLL殼層中存在三種類型的氨基基團(tuán),分別位于殼層的內(nèi)部、中部和表面,其中表面氨基濃度為12nmo1/mL。通過碳二亞胺反應(yīng)將TPP基團(tuán)偶聯(lián)到納米顆粒表面,利用核磁共振和吸收光譜分析證明TPP偶聯(lián)修飾得到實現(xiàn)。對TPP偶聯(lián)納米顆粒進(jìn)行共聚焦顯微鏡成像和斷層掃描成像,證明其可以被細(xì)胞有效攝取,并成功地靶向細(xì)胞線粒體。 3、制備了三類分別靶向細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)的熒光氧氣納米傳感器,基于時間分辨熒光方法檢測肝癌細(xì)胞HepG2和正常肝細(xì)胞L02的呼吸效率,評估腫瘤細(xì)胞線粒體的功能障礙。三類靶向性氧氣納米傳感器具有相同的核心基質(zhì)(包括PS、 DTS、C6和氧氣探針PtTFPP),但表面殼層卻各不相同,Si-NPs具有帶負(fù)電的二氧化硅表面,PLL-NPs表面是帶正電的PLL殼層,TPP-NPs表面偶聯(lián)TPP基團(tuán)。通過共聚焦顯微鏡和細(xì)胞超薄切片透射電子顯微鏡成像證明Si-NPs、PLL-NPs和TPP-NPs分別靶向細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)和線粒體。對負(fù)載三類納米傳感器的細(xì)胞在不同溶氧量環(huán)境中的熒光壽命進(jìn)行檢測,成功繪制細(xì)胞內(nèi)納米傳感器的溶氧量標(biāo)定曲線�；诎邢蛐约{米傳感器可以實時對亞細(xì)胞水平溶氧量梯度進(jìn)行檢測。對比腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞在不同葡萄糖水平下的氧氣消耗速率,發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞有氧呼吸過程中的葡萄糖利用率較低。將FCCP刺激下的腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的呼吸速率進(jìn)行對比,證明腫瘤細(xì)胞呼吸速率低,線粒體存在功能障礙。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TP212
【目錄】：

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本文編號：184445