本文選題：發(fā)光二極管　切入點：相關(guān)色溫　出處：《浙江大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分不同相關(guān)色溫的LED白光輻射對人晶體上皮細胞氧化應(yīng)激及DNA損傷的實驗研究目的氧化應(yīng)激造成的晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cells, HLECs)損傷是白內(nèi)障形成的最重要因素之一。發(fā)光二極管(light-emitting diodes, LED)產(chǎn)生的復色白光中含有高比例的短波藍光成分,長期的LED白光暴露可能造成對HLECs氧化損傷。本研究探討了不同相關(guān)色溫(correlated color temperature, CCT)的LED白光對體外培養(yǎng)的HLECs的細胞增殖,細胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species, ROS), DNA損傷,細胞周期及凋亡的影響,初步探究LED光源的眼生物安全性。方法培養(yǎng)的HLECs暴露于CCT分別為2954K,5624K及7378K的LED復色白光輻射下,LED系統(tǒng)(中國鴻雁電器科技公司提供)光照循環(huán)周期為16小時-開/8小時-關(guān)。在不同光照度及不同時間的光輻射暴露后,利用CCK-8法檢測細胞增殖,2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(H2DCFHDA)探針法檢測胞內(nèi)ROS,堿性彗星試驗檢測DNA損傷,流式法檢測細胞周期及細胞凋亡,蛋白免疫印跡及實時定量PCR (RT-qPCR)檢測PARP-1, p53及p21 mRNA及蛋白表達。結(jié)果與正常對照組相比,在1500lux的7378K LED白光刺激2天后,細胞增殖活力的顯著降低,而2954K組及5624K組未觀察到顯著性改變。在2500lux 7378KLED白光刺激3天后,HLECs的細胞活力下降68.26%；在不同光照度及輻射時間下,7378K組造成了細胞內(nèi)最為顯著的ROS增加；堿性彗星實驗顯示2954KLED白光對DNA未造成顯著的損傷,而5624K組及7378K組DNA損傷均顯著增多；5624K及7378K 15001ux刺激2天后,HLECs出現(xiàn)G2/M期阻滯,而2954K組無顯著改變；僅7378K組在1500及25001ux光照度下可以引起顯著的細胞凋亡增多,PARP-1, p53及p21 waf1/cipl表達均顯著上升。結(jié)論與2954K及5624K LED白光相比,CCT較高的7378K LED復色白光暴露能誘導HLECs內(nèi)ROS的過度生成,從而抑制細胞增殖活力,造成顯著的DNA損傷,誘導了細胞G2/M期阻滯及凋亡。第二部分兩種不同相關(guān)色溫的LED白光輻射對人原代視網(wǎng)膜色素上皮細胞病理性細胞因子表達影響及相關(guān)信號通路機制研究目的年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)是老年人失明的主要原因。最近的系統(tǒng)性回顧研究顯示,過度的日光(含藍光)暴露增加AMD的患病風險。隨著高效的發(fā)光二極管(light-emitting diodes, LED)發(fā)光技術(shù)在我們生活環(huán)境中的廣泛使用,LED產(chǎn)生的大量藍光對眼組織的潛在氧化應(yīng)激損傷威脅不容忽視。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)是眼組織病理性細胞因子的主要來源,調(diào)節(jié)外層視網(wǎng)膜局部炎癥反應(yīng)和血管生成。本研究探討了兩種不同相關(guān)色溫(correlated color temperature, CCT)的LED白光對分離的原代人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cells, RPECs)幾種病理性細胞因子表達、分泌的影響及其相關(guān)分子機制。方法采用改良的二步酶化法從從正常捐獻者眼球中分離人原代RPECs,以合適的細胞密度種板生長至融合。CCT分別為2954K和7378 K的兩種復色白光LED以1500lux光照度,2h-開/20min-關(guān)的光照周期輻射刺激已融合的原代細胞。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)及實時熒光定量PCR (RT-qPCR)分別檢測VEGF-A, IL-6, IL-8及MCP-1蛋白分泌及基因表達變化。采用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs),蛋白激酶B(Akt), Janus激酶(Janus kinase, JAK)和核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclear factor-κB, NF-κB)等信號通路在LED光刺激后的活化程度。采用氯甲基-2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(CM-H2DCFDA)檢測胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的水平。此外,抗氧化劑及信號通路的靶向分子抑制劑用于進一步研究相關(guān)機制。結(jié)果我們通過改良的酶化法成功地從捐獻者眼杯中分離出具有生長活性的原代RPECs,以適宜的種板密度使得原代細胞在體外生長融合后,仍保持了RPECs的上皮表型；分離培養(yǎng)的原代RPECs基礎(chǔ)狀態(tài)下具有旺盛的細胞因子分泌特征,顯著高于永生化ARPE-19細胞株；ELISA及RT-qPCR的結(jié)果顯示7378K LED白光刺激原代RPECs刺激后,VEGF-A, IL-6及IL-8蛋白分泌及基因表達均顯著增高,MCP-1顯著降低,而2954K組未發(fā)生類似改變；信號通路分子的免疫印跡實驗顯示7378K LED白光可顯著激活MAPKs (ERK1/2, p38 MAPK及JNK1/2)及核蛋白NF-κB信號通路；機制分析提示：清除細胞內(nèi)ROS及靶向抑制MAPKs和NF-κB信號通路可顯著緩解7378K LED白光誘導的相關(guān)病理性細胞因子的變化。結(jié)論高CCT的7378K LED白光可通過激活MAPKs及NF-κB信號通路,造成人原代RPECs中VEGF-A, IL-6, IL-8及MCP-1的表達變化�？寡趸瘎┘癕APKs、 NF-κB信號通路靶向分子抑制劑可顯著緩解LED白光誘導的相關(guān)病理細胞因子的變化。第三部分不同相關(guān)色溫的LED白光輻射對小鼠視網(wǎng)膜組織損傷及全基因組表達譜的影響目的與傳統(tǒng)人工光源及日光光譜不同,如今普及使用的新型發(fā)光二極管(light-emitting diodes, LED)白光光譜中具有一個強烈的短波藍光波峰。LED產(chǎn)生的高強度的藍光可能存在著對視網(wǎng)膜的潛在光毒性損傷,引起人們對其生物安全性的擔憂。通過優(yōu)化LED光譜可能有助于減少其造成的視網(wǎng)膜光毒性,本研究探討了不同相關(guān)色溫(correlated color temperature, CCT)的LED白光對小鼠視網(wǎng)膜組織損傷及視網(wǎng)膜組織全基因表達譜的影響。方法正常10周齡雌性Babl/c小鼠暴露于CCT分別為2954K,5624K及7378K的LED復色白光輻射下,以250、500、1000、3000lux光照度,刺激7天、14天及28天(光照周期為12小時-亮/12小時-暗)。在不同光照度及不同時間的LED白光輻射后,利用蘇木精伊紅(Hematein and Eosin, HE)染色檢測視網(wǎng)膜組織形態(tài)學,原位末端標記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)法檢測視網(wǎng)膜外核層(outer nuclear layer, ONL)細胞凋亡,并采用小鼠視網(wǎng)膜Affymetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0全基因組表達譜芯片比較2954K及7378K兩種不同CCT的LED白光對小鼠視網(wǎng)膜基因表達的整體差異性。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示：光輻射損傷導致小鼠的視網(wǎng)膜損傷主要表現(xiàn)為ONL變薄,細胞核數(shù)量減少。7378K LED白光,2501ux刺激28天后,ONL細胞核數(shù)量顯著減少。而2954K LED白光直至光照度提升至30001ux才導致小鼠ONL數(shù)量顯著下降,數(shù)量下降趨勢仍低于7378K組；在3000lux光照度刺激下,5624K組及7378K組小鼠ONL出現(xiàn)了顯著增多的TUNEL陽性細胞核,而在1000lux光照度刺激下,未觀察到顯著增多的陽性細胞；小鼠視網(wǎng)膜全基因表達譜芯片分析顯示：7378K與對照組比較中,121個基因表達上調(diào),458個基因表達下調(diào),而在2954K與對照組比較中,59個基因表達上調(diào),僅4個基因表達下調(diào)；對差異基因的GO和KEGG富集分析,7378K組的差異表達基因,參與了341個相關(guān)Term/GO,16條相關(guān)Pathway; 2954K組差異表達基因,參與12個Term/GO,7條相關(guān)Pathway。結(jié)論LED白光對小鼠視網(wǎng)膜損傷呈現(xiàn)CCT依賴性,7378K LED白光更易造成小鼠視網(wǎng)膜損傷,顯著降低ONL細胞核數(shù)量,然而細胞凋亡途徑可能并非是唯一的損傷機制。小鼠視網(wǎng)膜表達譜芯片分析結(jié)果進一步支持了2954K及7378K兩種不同CCT的LED白光對小鼠視網(wǎng)膜影響的差異性,通過優(yōu)化CCT參數(shù)有助于提高LED光源的生物安全性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：TN312.8;R77

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本文編號：1601659