本文關(guān)鍵詞：DNA修復(fù)酶活性檢測的熒光生物傳感方法研究　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：DNA修復(fù)酶能參與DNA損傷的修復(fù)過程,保護(hù)基因組免受DNA損傷的危害,進(jìn)而維持基因組的完整性。DNA修復(fù)酶活性的異常將對DNA損傷的修復(fù)過程產(chǎn)生干擾,從而導(dǎo)致各種疾病,包括早熟衰老癥、發(fā)育障礙、腫瘤、神經(jīng)退化性疾病等。因此,對DNA修復(fù)酶活性的檢測,有利于在功能研究和臨床診斷中評價DNA損傷的修復(fù)過程。近年來,由于具有操作簡捷、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn),基于DNA的熒光生物傳感方法已成為定量檢測生物分子的常用分析方法。這種方法將DNA作為識別探針來對特定的目標(biāo)物進(jìn)行識別,并能將該識別事件轉(zhuǎn)換成可以檢測的熒光信號。目前,基于DNA的熒光生物傳感方法已被用于DNA修復(fù)酶的活性檢測中。然而,這些方法仍存在一些不足：1)需要標(biāo)記或修飾,以及靈敏度低；2)需要同時移除多個損傷堿基才能實(shí)現(xiàn)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),限制了靈敏度的提高；3)每種方法只能對一種DNA修復(fù)酶的活性進(jìn)行檢測,不足以評價DNA損傷的修復(fù)過程。本論文發(fā)展了檢測DNA修復(fù)酶活性的新型熒光生物傳感方法。其中,尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)、內(nèi)切酶Ⅳ(Endo Ⅳ)以及無嘌呤/無嘧啶內(nèi)切酶1(APE1)被選作DNA修復(fù)酶的模型。本論文主要分為四章：第一章為緒論部分,主要概述了DNA修復(fù)酶的概念、分類、功能、研究意義以及現(xiàn)有的檢測方法。此外,本部分還總結(jié)了現(xiàn)階段DNA修復(fù)酶活性檢測領(lǐng)域中存在的主要問題。第二章,構(gòu)建了一種基于免標(biāo)記DNA機(jī)器的熒光信號擴(kuò)增方法用于靈敏檢測UDG的活性。在本方法中,我們設(shè)計了一個含有尿嘧啶(U)堿基和引物序列的雙鏈DNA探針,它作為DNA機(jī)器的引發(fā)部分能進(jìn)行UDG的識別和信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外,我們還設(shè)計了兩個部分互補(bǔ)的發(fā)夾探針,它們作為DNA機(jī)器的運(yùn)行部分能用于信號的擴(kuò)增。在UDG的作用下,雙鏈DNA探針中的U堿基被移除,產(chǎn)生無嘌呤/無嘧啶(AP)位點(diǎn),導(dǎo)致雙鏈結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而發(fā)生解離,釋放出引物序列。隨后,該引物序列能引發(fā)DNA機(jī)器的運(yùn)行,產(chǎn)生大量的G-四倍體(G4)結(jié)構(gòu)。最后,G4結(jié)構(gòu)能與N-甲基-卟啉Ⅸ(NMM)發(fā)生特異性地結(jié)合,生成G4-NMM復(fù)合物,并產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光信號。本方法能檢測低至0.00044 U/mL的UDG活性。本方法也能用于檢測人宮頸癌(HeLa)細(xì)胞裂解液中的UDG活性。另外,本方法也能成功檢測抑制劑對UDG活性的抑制。第三章,構(gòu)建了一種基于粘性末端介導(dǎo)鏈置換的熒光信號擴(kuò)增方法,它能對少量U堿基的移除產(chǎn)生響應(yīng),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對UDG活性的靈敏檢測。在本方法中,我們設(shè)計了一個單鏈DNA識別探針,它含有引物序列和兩個U堿基。另外,我們還設(shè)計了一個含有粘性末端的發(fā)夾探針,以及一個信號報道探針。在UDG的作用下,單鏈DNA探針中的兩個U堿基被移出,產(chǎn)生AP位點(diǎn)。該含有AP位點(diǎn)的單鏈DNA探針將不能與含粘性末端的發(fā)夾探針發(fā)生粘性末端介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)(TSDR),從而使單鏈DNA探針中的引物序列仍能自由存在。隨后,該引物序列與信號報道探針發(fā)生雜交,進(jìn)而引發(fā)聚合切刻等溫擴(kuò)增反應(yīng),實(shí)現(xiàn)了對少量U堿基移除的靈敏響應(yīng),提高了檢測UDG活性的靈敏度。然而,當(dāng)UDG不存在時,單鏈DNA探針能與含粘性末端的發(fā)夾探針發(fā)生TSDR,導(dǎo)致引物序列被封閉,從而不能引發(fā)后續(xù)的等溫擴(kuò)增反應(yīng),降低了陰性信號。本方法能檢測低至0.000027 U/mL的UDG活性。第四章,構(gòu)建了一種雙識別發(fā)夾探針介導(dǎo)的熒光信號擴(kuò)增方法用于靈敏且選擇性地檢測UDG和Endo Ⅳ的活性。當(dāng)檢測UDG的活性時,探針中的U堿基被目標(biāo)酶移除,產(chǎn)生AP位點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了對UDG的識別。接著,AP位點(diǎn)被工具酶Endo Ⅳ切刻,從而使探針釋放出引物序列以引發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)反應(yīng)。最后,RCA反應(yīng)產(chǎn)生大量重復(fù)的G4序列以進(jìn)行熒光信號的輸出。另外,當(dāng)檢測Endo Ⅳ的活性時,探針中的U堿基首先被工具酶UDG轉(zhuǎn)換成AP位點(diǎn)。接著,AP位點(diǎn)被目標(biāo)酶切刻,實(shí)現(xiàn)了對Endo Ⅳ的識別。最后,結(jié)合RCA的信號擴(kuò)增能力,實(shí)現(xiàn)對Endo Ⅳ活性的靈敏檢測。本方法對UDG和Endo Ⅳ活性的檢測限分別為0.00017 U/mL和0.11 U/mL。并且,本方法能將UDG和Endo Ⅳ與相應(yīng)的類似物很好地區(qū)分開來。另外,本方法也實(shí)現(xiàn)了對APE1活性的檢測。第五章,利用連接酶反應(yīng),構(gòu)建了一種熒光信號擴(kuò)增方法用于檢測UDG的活性。當(dāng)UDG存在時,識別探針中的兩個U堿基被移除而產(chǎn)生AP位點(diǎn),形成錯配切口�；贒NA連接酶能夠連接兩側(cè)堿基對完全匹配的切口而不能連接3’側(cè)含錯配的切口的性質(zhì),形成的上述錯配切口將不能被DNA連接酶連接,探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)保持完整,進(jìn)而引發(fā)隨后的信號擴(kuò)增及產(chǎn)生過程,實(shí)現(xiàn)了對少量U堿基移除的靈敏響應(yīng),有助于提高UDG活性的檢測靈敏度。第六章為結(jié)論部分,主要總結(jié)了本論文的創(chuàng)新點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O657.3;TP212
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本文編號：1328341