本文關(guān)鍵詞：水稻細(xì)菌性褐條病菌致病機(jī)理及其氧脅迫相關(guān)基因簇調(diào)控蛋白TetR的功能分析

  更多相關(guān)文章： 稻嗜酸菌 致病性 pilP基因 六型分泌系統(tǒng) TetR蛋白 活性氧脅迫

【摘要】：水稻細(xì)菌性褐條病是水稻的常見病害之一,其病原細(xì)菌為稻嗜酸菌Acidovorax oryzae,它是一種革蘭氏陰性植物致病菌。盡管這種病害已在世界范圍內(nèi)引起了較嚴(yán)重的水稻產(chǎn)量、質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)損失,但目前對(duì)該細(xì)菌在分子和細(xì)胞水平的致病機(jī)理及生理特性的認(rèn)知仍然不夠詳盡。 近年來的研究表明,Ⅳ型菌毛與細(xì)菌的致病性等生理生化性狀有緊密聯(lián)系,此外,細(xì)菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)是近些年才被發(fā)現(xiàn)和歸納的一類新型分泌系統(tǒng),它也與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Ⅳ型菌毛中重要基因pilP的功能展開詳細(xì)研究,證明了pilP基因能夠在細(xì)菌的致病性、游動(dòng)能力、菌毛形成和生物膜形成等方面發(fā)揮重要影響；基于蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)比對(duì)等方法,本實(shí)驗(yàn)室先前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了在Acidovorax oryzae RS-1菌株中也存在著Ⅵ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu),但是對(duì)于其中的關(guān)鍵組分icmF基因與dotU基因所發(fā)揮的功能和他們之間的關(guān)系并不明確。因此,本研究通過構(gòu)造基因功能缺失突變體,證明了缺失了icmF基因或者dotU基因的突變體,其致病能力大為減弱,表明RS-1中的Ⅵ型分泌系統(tǒng)同樣會(huì)影響細(xì)菌的致病性,又通過細(xì)菌雙雜交實(shí)驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了icmF基因與dotU基因之間存在相互作用。 通過將A. oryzae RS-1的基因組與它的兩個(gè)近緣菌株A. oryzae ATCC19860和A. citrulli AAC00-1進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)了存在于RS-1上的一個(gè)與活性氧脅迫相關(guān)的基因簇,系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明該基因簇是通過Pseudonymous菌基因水平轉(zhuǎn)移獲得的。在該基因簇上存在一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因tetR,通過構(gòu)建突變體,研究分析表明此基因所編碼的蛋白在基因簇中起到抑制子的功能,該基因缺失后細(xì)胞對(duì)于活性氧的耐受能力增強(qiáng),超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的酶活性也有所升高。熒光定量PCR表明tetR基因可以影響到該基因簇上其他基因以及超氧化物歧化酶和過氧化氫酶相關(guān)基因的表達(dá),這也為tetR基因缺失菌株的相關(guān)生理變化提供了合理的解釋和證明。從凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析TetR蛋白可以直接結(jié)合到該基因簇的啟動(dòng)子區(qū)域從而進(jìn)行調(diào)控。質(zhì)譜分析結(jié)果表明TetR蛋白能夠影響共計(jì)111個(gè)細(xì)胞質(zhì)蛋白的表達(dá),通過COG分析,將這些差異蛋白的功能進(jìn)行歸納總結(jié),發(fā)現(xiàn)了這些差異蛋白其功能大多與細(xì)胞的能量代謝和轉(zhuǎn)換、細(xì)胞移動(dòng)能力、轉(zhuǎn)錄后修飾、以及細(xì)胞分裂有關(guān)。這項(xiàng)結(jié)果更加印證了tetR基因缺失后細(xì)菌的生理變化,也為研究A. oryzae提供了更詳細(xì)的依據(jù)。綜上,TetR蛋白作為轉(zhuǎn)錄抑制子,可以通過調(diào)控A. oryzae中一系列基因的表達(dá),從而影響該細(xì)菌對(duì)活性氧脅迫環(huán)境的適應(yīng)性,這種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制在細(xì)菌進(jìn)化過程中起到重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：稻嗜酸菌 致病性 pilP基因 六型分泌系統(tǒng) TetR蛋白 活性氧脅迫
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S435.111.4
【目錄】：

• 目錄6-9
• 致謝9-12
• 序言12-13
• 摘要13-15
• ABSTRACT15-17
• 1 緒論17-33
• 1.1 水稻細(xì)菌性褐條病及其致病細(xì)菌17-19
• 1.1.1 水稻細(xì)菌性褐條病的發(fā)生與危害及其病原物17-18
• 1.1.2 水稻細(xì)菌性褐條病的防治18-19
• 1.2 細(xì)菌Ⅳ型菌毛19-23
• 1.2.1 細(xì)菌菌毛的生理功能和分類19-20
• 1.2.2 細(xì)菌Ⅳ型菌毛的相關(guān)基因及研究進(jìn)展20-22
• 1.2.3 細(xì)菌Ⅳ型菌毛與細(xì)菌的游動(dòng)性、生物膜形成以及致病性的關(guān)系22-23
• 1.3 細(xì)菌的Ⅵ型分泌系統(tǒng)23-27
• 1.3.1 細(xì)菌的分泌系統(tǒng)和Ⅵ型分泌系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)23-24
• 1.3.2 T6SS的結(jié)構(gòu)組成24-27
• 1.4 細(xì)菌基因組進(jìn)化過程中的基因水平轉(zhuǎn)移27-29
• 1.4.1 基因組進(jìn)化過程中的基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制27
• 1.4.2 細(xì)菌基因水平轉(zhuǎn)移的方式27-28
• 1.4.3 細(xì)菌基因水平轉(zhuǎn)移的檢測(cè)方法28-29
• 1.5 TetR調(diào)控蛋白與氧脅迫環(huán)境29-31
• 1.5.1 氧脅迫環(huán)境(Oxidative Stress)29-30
• 1.5.2 TetR蛋白質(zhì)家族30-31
• 1.6 本研究的內(nèi)容和意義31-33
• 2 材料與方法33-58
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑33-35
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、質(zhì)粒載體和試劑33
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和培養(yǎng)基33-35
• 2.2 常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作35-41
• 2.2.1 常規(guī) PCR35-36
• 2.2.2 酶切和連接反應(yīng)體系36
• 2.2.3 熱激、電擊和濾膜雜交轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)36-38
• 2.2.4 質(zhì)粒提取、細(xì)菌基因組DNA提取38-40
• 2.2.5 地高辛標(biāo)記探針的Southern雜交(Southern Blot)40-41
• 2.3 A. oryzae突變體的構(gòu)建和回補(bǔ)41-44
• 2.3.1 單交換同源重組構(gòu)建pilP、icmF、dotU基因的插入突變41-42
• 2.3.2 雙交換同源重組構(gòu)建tetR基因的缺失突變42-44
• 2.4 接種實(shí)驗(yàn)和細(xì)菌致病性測(cè)定44
• 2.5 水稻細(xì)菌性褐條病菌A. oryzae中pilP基因的生物學(xué)性狀測(cè)定44-45
• 2.5.1 生物膜測(cè)定44-45
• 2.5.2 細(xì)菌游動(dòng)性測(cè)定45
• 2.5.3 菌落形態(tài)的透射電鏡觀察(Transmission electron microscopy,TEM)45
• 2.6 水稻細(xì)菌性褐條病菌A. oryzae中icmF和dotU基因的相互作用研究45-48
• 2.6.1 雙分子熒光互補(bǔ)(Biomolecular Fluorescence Complementation,BiFC)45-47
• 2.6.2 細(xì)菌雙雜交(Bacterial two-hybrid,BACTH)47-48
• 2.7 水稻細(xì)菌性褐條病菌A. oryzae RS-1中tetR基因和所在基因簇的功能分析48-58
• 2.7.1 比較基因組和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹48
• 2.7.2 細(xì)胞在不同濃度氧脅迫環(huán)境下的存活率測(cè)定48-49
• 2.7.3 細(xì)胞質(zhì)蛋白的提取、1D蛋白質(zhì)電泳和質(zhì)譜49-52
• 2.7.4 SOD和CAT酶活性測(cè)定52
• 2.7.5 Real-Time PCR檢測(cè)52-54
• 2.7.6 TetR蛋白的表達(dá)純化54-55
• 2.7.7 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic Mobility Shift Assays,EMSA)55-58
• 3 結(jié)果與分析58-87
• 3.1 水稻細(xì)菌性褐條病菌A. oryzae中pilP基因的功能鑒定58-65
• 3.1.1 敲除pilP基因后,A. oryzae致病性顯著下降59-61
• 3.1.2 pilP基因缺失后,細(xì)菌喪失菌圈和Ⅳ型菌毛61-63
• 3.1.3 pilP基因能夠影響A. oryzae的游動(dòng)性及生物膜形成63-65
• 3.1.4 pilP基因在A. oryzae上的功能小結(jié)65
• 3.2 水稻細(xì)菌性褐條病菌A. oryzae中icmF和dotU基因的相互作用65-70
• 3.2.1 T6SS能夠影響A. oryzae細(xì)菌致病性65-68
• 3.2.2 icmF和dotU基因的互作68-70
• 3.3 水稻細(xì)菌性褐條病菌A. oryzae中氧脅迫相關(guān)基因簇的發(fā)現(xiàn)以及tetR轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的功能分析70-87
• 3.3.1 tetR轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因及其所在的基因簇的發(fā)現(xiàn)70-74
• 3.3.2 tetR基因突變體對(duì)活性氧脅迫的耐受力增強(qiáng)74-78
• 3.3.3 tetR基因突變后,A. oryzae菌中SOD和CAT酶的活性升高78-79
• 3.3.4 通過LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定受TetR蛋白調(diào)控的其他細(xì)胞質(zhì)蛋白79-82
• 3.3.5 熒光定量PCR分析TetR調(diào)控蛋白對(duì)其他基因表達(dá)的影響82-83
• 3.3.6 TetR蛋白能夠直接結(jié)合在pqiA'和tetR之間的啟動(dòng)子區(qū)域83-85
• 3.3.7 TetR蛋白的功能總結(jié)85-87
• 4 討論87-91
• 5 全文總結(jié)91-93
• 5.1 A. oryzae RS-1的致病機(jī)制研究91
• 5.2 A. oryzae RS-1中活性氧脅迫相關(guān)基因簇和調(diào)控蛋白TetR91-93
• 參考文獻(xiàn)93-106
• 附錄106-123
• 附錄1 本研究用到的菌株和質(zhì)粒106-109
• 附錄2 本研究用到的PCR引物列表109-111
• 附錄3 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定出的RS-1和RS-tetR之間的差異蛋白111-117
• 附錄4 本研究所用到的載體圖譜117-123
• 作者簡(jiǎn)介123
• 主要發(fā)表論文123

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李俊平,朱文華;水稻細(xì)菌性褐條病的發(fā)生及防治[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2003年02期

2 梁景平;菌毛的類型及其作用機(jī)制[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊(cè);1998年01期

3 牟希亞;郭雁群;田浩泉;;細(xì)菌普通菌毛的性質(zhì)和作用[J];國外醫(yī)學(xué)(微生物學(xué)分冊(cè));1980年06期

4 李鳳云;黃谷良;;細(xì)菌菌毛與致病[J];國外醫(yī)學(xué)(微生物學(xué)分冊(cè));1984年01期

5 ;Construction of DNA damage response gene pprI function-deficient and function-complementary mutants in Deinococcus radiodurans[J];Chinese Science Bulletin;2005年04期

6 顏曰紅;蔡方義;黃賢華;;水稻細(xì)菌性褐條病的發(fā)生與防治[J];農(nóng)業(yè)科技通訊;2006年03期

7 吳惠秋;徐恩麗;于洋洋;田艷麗;錢國良;劉鳳權(quán);胡白石;;梨火疫病菌luxR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的克隆與功能分析[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2013年06期

8 彭玉燈;;南方稻區(qū)細(xì)菌性褐條病發(fā)生特點(diǎn)及控防措施[J];上海農(nóng)業(yè)科技;2008年03期

9 王磊;劉斌;;基因橫向轉(zhuǎn)移在細(xì)菌進(jìn)化中的作用[J];天津科技;2011年02期

10 江凌曉,俞守義;基因水平轉(zhuǎn)移[J];中國地方病學(xué)雜志;2004年05期

，

本文編號(hào)：998844