發(fā)布時(shí)間：2017-10-05 16:13

  本文關(guān)鍵詞：葡萄WRKYs響應(yīng)葡萄根瘤蚜侵害的分子機(jī)理

  更多相關(guān)文章： 葡萄 根瘤蚜 侵害 WRKY PRs 防御反應(yīng)

【摘要】：葡萄根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae Fitch)專性寄生于葡萄根系和葉片,歷史上曾對歐洲葡萄造成了毀滅性為害。目前生產(chǎn)上主要通過使用抗性砧木嫁接防治根瘤蚜,但我們對葡萄砧木抗根瘤蚜侵害的分子機(jī)理還知之甚少。植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物界數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,本論文以敏感品種克瑞森和抗性砧木1103Paulsen為試材,探究了葡萄WRKYs對根瘤蚜侵害的應(yīng)答反應(yīng),主要研究結(jié)果如下。1、葡萄(Vitis vinifera L.)中共發(fā)現(xiàn)63個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因。根據(jù)擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子的分類原則,除VvWRKY32-2外其它共分成3大類和7個(gè)亞類,63個(gè)葡萄WRKY基因不均勻地分布在除第3號染色體外的其它18條染色體和一條未知染色體上,亞細(xì)胞定位預(yù)測軟件分析表明絕大多數(shù)葡萄WRKY定位于細(xì)胞核。外顯子及蛋白長度分析表明序列缺失參與WRKY進(jìn)化,而基因組復(fù)制促進(jìn)了WRKY家族成員擴(kuò)增。在發(fā)育的葡萄果實(shí)各組織(果皮、果肉和種子)中,葡萄WRKY基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)豐度,還有一些基因表達(dá)存在明顯的時(shí)空特異性。2、WRKY基因響應(yīng)葡萄-根瘤蚜之間的互作反應(yīng)。根瘤蚜侵染導(dǎo)致敏感品種克瑞森30多個(gè)WRKY基因的表達(dá)量發(fā)生變化,多數(shù)基因的表達(dá)量上調(diào),僅Vv WRKY20、24、42、49和51-2表達(dá)量顯著下調(diào)。抗性砧木1103 Paulsen(V.Berlandieri×V.Rupetris)WRKY基因表達(dá)量變化與克瑞森基本一致,但VvWRKY2-2和VvWRKY42在1103Paulsen中的表達(dá)模式與克瑞森相反,這可能是決定不同基因型葡萄對根瘤蚜抗性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。根結(jié)形成時(shí)部分WRKY基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式,與未侵染的對照相比根結(jié)中VvWRKY2和VvWRKY46表達(dá)量下調(diào),而Vv WRKY51-1、VvWRKY53和Vv WRKY55表達(dá)量升高,表明WRKY基因正/負(fù)調(diào)節(jié)葡萄對根瘤蚜的防御反應(yīng)。另外,WRKY基因在靠近根結(jié)未被侵害的根中也表現(xiàn)出與根結(jié)中類似的表達(dá)模式,說明根瘤蚜對葡萄WRKY基因的誘導(dǎo)是系統(tǒng)性的。3、我們同時(shí)檢測了部分WRKY基因在敏感、中抗和免疫葡萄根系和葉片中的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄根系和葉片中WRKY基因組成型表達(dá)量與其根瘤蚜抗性強(qiáng)弱無相關(guān)性,根瘤蚜侵害能夠啟動(dòng)葡萄WRKY基因介導(dǎo)的誘導(dǎo)型防御反應(yīng)。4、葡萄SA信號途徑相關(guān)基因參與葡萄-根瘤蚜互作反應(yīng)。根瘤蚜瞬時(shí)侵害抑制SA積累相關(guān)基因如VvPAD4和VvMATE的表達(dá),使根系和葉片中總SA含量分別下降24%和58%,但同時(shí)誘導(dǎo)1103Paulsen根系中PRs基因表達(dá)量上調(diào),如VvG1、VvCHI1B、VvCHI1B1和PR3。施用外源SA和Me-JA分別降低根瘤蚜若蟲成活率50%和24%。推測PRs基因的上調(diào)與總SA的下降無關(guān),是受到其它因子的調(diào)控。另外,VvCHI1B在1103P形成的根結(jié)中表達(dá)量上調(diào)了50倍,而在克瑞森的根結(jié)中表達(dá)量下調(diào)。5、擬南芥同源基因功能分析推測VvWRKY40-1和VvWRKY46參與葡萄SA信號途徑,且與克瑞森相比這兩個(gè)基因在1103Paulsen中持續(xù)響應(yīng)根瘤蚜侵害。Race結(jié)果表明VvWRKY40-1和VvWRKY46的開放閱讀框長度分別是954bp和1050bp,其編碼的蛋白都定位于細(xì)胞核。瞬時(shí)表達(dá)和體外試驗(yàn)證明VvWRKY40-1和VvWRKY46蛋白能夠與順式作用元件Wbox(T)(T)TGAC(C/T)結(jié)合互作,啟動(dòng)下游基因表達(dá)。酵母單雜交和同源共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VvWRKY40-1和VvWRKY46蛋白分別與VvCHI1B基因啟動(dòng)子互作,這表明WRKY蛋白能在轉(zhuǎn)錄水平直接調(diào)節(jié)PRs基因的表達(dá)參與葡萄對根瘤蚜防御反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：葡萄 根瘤蚜 侵害 WRKY PRs 防御反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S436.631
【目錄】：

• 摘要13-15
• Abstract15-18
• 1 前言18-35
• 1.1 葡萄根瘤蚜的危害18
• 1.2 敏感葡萄對根瘤蚜侵染的響應(yīng)18-20
• 1.2.1 根瘤蚜侵染對敏感葡萄組織結(jié)構(gòu)的影響18-19
• 1.2.2 敏感葡萄對根瘤蚜侵染的生理生化響應(yīng)19-20
• 1.2.3 敏感葡萄在根瘤蚜侵染過程中的分子響應(yīng)20
• 1.3 抗性砧木對根瘤蚜侵害的防御反應(yīng)20-22
• 1.3.1 抗性砧木組織結(jié)構(gòu)特性20-21
• 1.3.2 抗性砧木的生理及分子響應(yīng)21-22
• 1.4 植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因的發(fā)現(xiàn)和分布22-24
• 1.5 WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因的起源及在植物中的進(jìn)化24
• 1.6 WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物對生物脅迫的抗性反應(yīng)24-29
• 1.6.1 植物WRKY對病原微生物的抗性防御反應(yīng)26-29
• 1.6.2 植物WRKY調(diào)節(jié)寄主與植物寄生害蟲間的互作反應(yīng)29
• 1.7 WRKY在植物抗病害防御反應(yīng)中的作用29-34
• 1.7.1 WRKY參與植物抗逆分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)30-32
• 1.7.1.1 WRKY調(diào)控植物SA信號途徑30-32
• 1.7.1.2 WRKY參與植物MAPK信號級聯(lián)反應(yīng)32
• 1.7.2 WRKY調(diào)節(jié)植物次生代謝物合成32-34
• 1.8 研究的目的和意義34-35
• 2 材料與方法35-59
• 2.1 材料35-41
• 2.1.1 植物材料35
• 2.1.2 葡萄根瘤蚜35
• 2.1.3 菌株35-36
• 2.1.4 載體36
• 2.1.5 酶、抗生素、及各種生物化學(xué)試劑36-37
• 2.1.6 儀器設(shè)備和耗材37
• 2.1.7 引物合成和序列測定37
• 2.1.8 培養(yǎng)基37-39
• 2.1.9 PNS營養(yǎng)液成分39-40
• 2.1.10 抗生素及其它試劑的配制40
• 2.1.11 溶液和緩沖液配制40-41
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法41-59
• 2.2.1 葡萄WRKY基因家族成員的鑒定和生物信息學(xué)分析41-42
• 2.2.1.1 葡萄WRKY基因家族成員的鑒定41-42
• 2.2.1.2 葡萄WRKY基因家族成員的生物信息學(xué)分析42
• 2.2.2 根瘤蚜培養(yǎng)和接種42-43
• 2.2.2.1 根瘤蚜室內(nèi)培養(yǎng)42
• 2.2.2.2 根瘤蚜接種42-43
• 2.2.3 葡萄扦插苗和組培苗培養(yǎng)43
• 2.2.3.1 葡萄扦插苗43
• 2.2.3.2 葡萄組培苗培養(yǎng)43
• 2.2.4 葡萄各組織總RNA提取—CTAB法43-44
• 2.2.5 葡萄總DNA提取—CTAB法44-45
• 2.2.6 反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成45-46
• 2.2.7 引物設(shè)計(jì)46
• 2.2.8 半定量RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR46-47
• 2.2.8.1 半定量RT-PCR46
• 2.2.8.2 qRT-PCR46-47
• 2.2.9 cDNA末端快速擴(kuò)增47-49
• 2.2.9.1 5'Race47-49
• 2.2.9.2 3'Race49
• 2.2.10 基因克隆49
• 2.2.11 瓊脂糖凝膠中DNA的回收49-50
• 2.2.12 克隆載體構(gòu)建50
• 2.2.13 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化50-51
• 2.2.13.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備50-51
• 2.2.13.2 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化51
• 2.2.14 根癌農(nóng)桿菌（LBA4404和GV3101）感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化51-52
• 2.2.14.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備51-52
• 2.2.14.2 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化—凍融熱擊法52
• 2.2.15 菌落PCR檢測陽性菌落52
• 2.2.16 質(zhì)粒DNA的提取52-53
• 2.2.17 質(zhì)粒DNA的酶切—快速酶切53
• 2.2.18 表達(dá)載體的構(gòu)建53-55
• 2.2.18.1 GFP融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建53-54
• 2.2.18.2 GUS表達(dá)載體的構(gòu)建54
• 2.2.18.3 過表達(dá)載體的構(gòu)建54-55
• 2.2.19 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞的亞細(xì)胞定位55
• 2.2.20 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)同源轉(zhuǎn)錄激活55-56
• 2.2.21 葡萄胚性愈傷的轉(zhuǎn)化56
• 2.2.22 酵母單雜交試驗(yàn)56-59
• 2.2.22.1 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備—Y18756-57
• 2.2.22.2 載體pHis2轉(zhuǎn)化57
• 2.2.22.3 篩選抑制HIS本底表達(dá)的 3-AT濃度57
• 2.2.22.4 互作驗(yàn)證57-59
• 3 結(jié)果與分析59-96
• 3.1 葡萄（Vitis vinifera L.）WRKY家族成員的鑒定和生物信息學(xué)分析59-69
• 3.1.1 葡萄（Vitis vinifera L.）包含63個(gè)WRKY基因59-62
• 3.1.2 葡萄WRKY蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析和分類62-63
• 3.1.3 葡萄WRKY的染色體定位及亞細(xì)胞定位預(yù)測63-64
• 3.1.4 葡萄WRKY蛋白保守域和基因結(jié)構(gòu)分析64-69
• 3.2 葡萄WRKY基因在發(fā)育果實(shí)中的組織表達(dá)特性69-72
• 3.2.1 VvWRKY在葡萄發(fā)育果實(shí)各組織中的表達(dá)70-71
• 3.2.2 抗病相關(guān)PR基因在發(fā)育的葡萄果實(shí)中的表達(dá)71-72
• 3.3 根瘤蚜刺吸影響敏感型品種克瑞森根系VvWRKY基因的表達(dá)72-75
• 3.3.1 克瑞森根系VvWRKY基因響應(yīng)根瘤蚜刺吸侵害72-74
• 3.3.2 熒光定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果74-75
• 3.4 根瘤蚜刺吸影響中抗砧木品種 1103P根系VvWRKY基因的表達(dá)75-77
• 3.4.1 1103P根系VvWRKYs基因的表達(dá)變化75-76
• 3.4.2 接種方法驗(yàn)證76-77
• 3.5 啟動(dòng)子響應(yīng)驗(yàn)證77
• 3.5.1 啟動(dòng)子克隆77
• 3.5.2 同源轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證77
• 3.6 根結(jié)形成過程中VvWRKYs基因在Crimson Seedless和 1103P根系中的表達(dá)變化77-79
• 3.7 VvWRKYs基因在不同敏感型葡萄中的組織表達(dá)特異性79-80
• 3.8 葡萄-根瘤蚜互作與植物內(nèi)源激素SA和JA的關(guān)系80-85
• 3.8.1 根瘤蚜刺吸對葡萄SA和JA信號途徑相關(guān)基因表達(dá)量的影響80-82
• 3.8.2 根結(jié)形成過程中SA相關(guān)基因的表達(dá)變化82-83
• 3.8.3 外源植物激素SA和JA對根瘤蚜成活率的影響83-84
• 3.8.4 根瘤蚜刺吸影響 1103P根系SA含量84
• 3.8.5 SA相關(guān)基因啟動(dòng)子序列分析84-85
• 3.9 VvWRKY40-1 和VvWRKY46基因的克隆85-86
• 3.9.1 VvWRKY40-1 和VvWRKY46基因Race全長85-86
• 3.9.2 VvWRKY40-1 和VvWRKY46基因全長克隆86
• 3.10 VvWRKY40-1 和VvWRKY46的亞細(xì)胞定位86-87
• 3.11 VvWRKY40-1 和VvWRKY46蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性87-92
• 3.11.1 葡萄葉片同源轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證87-90
• 3.11.2 酵母單雜交轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證90-92
• 3.12 VvWRKY40-1 和VvWRKY46蛋白與VvCHI1B、VvCHI1B1、Vv G1基因啟動(dòng)子互作驗(yàn)證92-96
• 3.12.1 體外驗(yàn)證試驗(yàn)93-95
• 3.12.2 VvWRKY40-1 和VvWRKY46蛋白分別與VvCHI1B基因啟動(dòng)子互作95-96
• 4 討論96-102
• 4.1 根瘤蚜侵害改變葡萄WRKY基因轉(zhuǎn)錄本96-97
• 4.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子正/負(fù)調(diào)節(jié)植物防御反應(yīng)97-98
• 4.3 WRKY調(diào)控SA信號途徑參與葡萄-根瘤蚜之間的互作98-99
• 4.4 植物PR基因的抗蟲作用99-100
• 4.5 WRKY調(diào)節(jié)植物PR基因的表達(dá)100-102
• 5 結(jié)論102-103
• 參考文獻(xiàn)103-124
• 附錄124-132
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文132-133
• 致謝133-134

【相似文獻(xiàn)】

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王鳳攀;葡萄WRKYs響應(yīng)葡萄根瘤蚜侵害的分子機(jī)理[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

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本文編號：977749