本文關(guān)鍵詞：DNA甲基化對(duì)小麥鹽脅迫應(yīng)答基因的影響研究

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【摘要】：作為全球三大糧食作物之一,小麥供養(yǎng)著30%以上的世界人口。而隨著全球氣候變暖、海平面上升、環(huán)境污染加重和城市化進(jìn)程加速,土壤鹽漬化這一現(xiàn)象日益嚴(yán)重,業(yè)已成為限制全球小麥產(chǎn)量的重要因素。DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一種,在植物體內(nèi)具有重要的作用。一方面,DNA甲基化通過(guò)沉默轉(zhuǎn)座子等功能來(lái)維持植物基因組的穩(wěn)定性,遠(yuǎn)緣雜交、異源多倍體化等引起的基因組沖擊可以導(dǎo)致DNA甲基化的重塑；另一方面,DNA甲基化可以調(diào)控植物功能基因的表達(dá),尤其是植物遭遇鹽、旱等非生物脅迫時(shí),非生物脅迫應(yīng)答基因的DNA甲基化狀態(tài)迅速發(fā)生動(dòng)態(tài)變化,實(shí)現(xiàn)應(yīng)答基因表達(dá)的誘導(dǎo)或者抑制。本研究從本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)體細(xì)胞雜交創(chuàng)制的耐鹽小麥漸滲系品種山融3號(hào)出發(fā),對(duì)比其親本普通六倍體小麥品種濟(jì)南177,證實(shí)了小麥鹽脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)受到其啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化修飾調(diào)控,并發(fā)現(xiàn)了體細(xì)胞雜交過(guò)程的基因組沖擊可以導(dǎo)致小麥DNA甲基化的重塑,這種重塑對(duì)于山融3號(hào)的耐鹽性狀具有一定的意義。同時(shí),鑒定出小麥中5個(gè)表達(dá)受DNA甲基化調(diào)控的鹽脅迫應(yīng)答基因,并在擬南芥和小麥中初步證實(shí)了這些基因?qū)τ谥参镯憫?yīng)鹽脅迫的作用。進(jìn)一步的,從遺傳變異、DNA甲基化變異、表達(dá)差異和蛋白功能差異等角度詳細(xì)闡釋了小麥耐鹽關(guān)鍵基因HKT1；5不同染色體組上部分同源基因的進(jìn)化命運(yùn)。1小麥漸滲系鹽脅迫應(yīng)答基因的DNA甲基化修飾調(diào)控研究通過(guò)HPLC和MSAP實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)小麥在受到鹽脅迫時(shí),全基因組水平的DNA甲基化狀態(tài)發(fā)生重塑。進(jìn)一步利用亞硫酸鹽法對(duì)小麥中24個(gè)鹽脅迫應(yīng)答基因進(jìn)行DNA甲基化測(cè)序掃描發(fā)現(xiàn),編碼區(qū)的胞嘧啶甲基化幾乎全部存在于CpG位點(diǎn),鹽處理后這些位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)變化與基因表達(dá)的變化沒(méi)有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。對(duì)于只在編碼區(qū)存在甲基化修飾的基因,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-azaC處理之后,這些基因編碼區(qū)發(fā)生顯著的去甲基化現(xiàn)象,但是其表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生變化,說(shuō)明小麥中編碼區(qū)DNA甲基化對(duì)于基因表達(dá)的調(diào)控作用不顯著。統(tǒng)計(jì)分析顯示,小麥中基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化不僅存在于CpG位點(diǎn),在CpNpG和CpNpN位點(diǎn)也有一定比例的存在。鹽處理后,啟動(dòng)子區(qū)域胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)發(fā)生變化,這種變化與對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)呈現(xiàn)“去甲基化-基因表達(dá)上調(diào),超甲基化-基因表達(dá)下調(diào)”的規(guī)律。進(jìn)一步用5-azaC處理,顯示啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生顯著的去甲基化現(xiàn)象,對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)被顯著的誘導(dǎo),說(shuō)明小麥中基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化對(duì)于基因的表達(dá)具有調(diào)控作用。雖然HPLC分析顯示體細(xì)胞雜交漸滲系小麥SR3與其母本JN177全基因組整體水平上DNA甲基化修飾比率基本相同,但是MSAP實(shí)驗(yàn)堿基水平顯示SR3與JN177之間許多胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)是不同的。更高分辨率的亞硫酸鹽測(cè)序數(shù)據(jù)表明,有21個(gè)胞嘧啶位點(diǎn)只在JN177中存在甲基化修飾,有10個(gè)位點(diǎn)則只在SR3中存在甲基化修飾。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明體細(xì)胞雜交過(guò)程中引起的基因組沖擊可以導(dǎo)致小麥DNA甲基化的重塑。進(jìn)一步分析表明,這種DNA甲基化的重塑對(duì)于SR3的耐鹽表型具有一定的意義。MSAP數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),對(duì)照情況下的SR3與鹽脅迫下的JN177有13個(gè)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)是一致的,這使得SR3中這些位點(diǎn)的DNA甲基化模擬了部分小麥鹽脅迫的響應(yīng)狀態(tài),從而導(dǎo)致SR3可以更加快速地應(yīng)答鹽脅迫。更有趣的是,通過(guò)亞硫酸鹽測(cè)序,發(fā)現(xiàn)SR3和JN177之間一些基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平存在差異,而且這種差異還與相應(yīng)基因在SR3和JN177之間的差異表達(dá)也存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。2小麥TaCYP81的克隆與耐鹽功能初步研究從上部分內(nèi)容出發(fā),發(fā)掘了一個(gè)受啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化調(diào)控而在SR3與JN177中鹽脅迫下表達(dá)模式存在差異的小麥TaCYP81基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),TaCYP81不僅在基因表達(dá)上受到鹽脅迫、過(guò)氧化氫脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo),而且其蛋白也受到鹽脅迫和過(guò)氧化氫脅迫影響而快速聚集到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,這與前人發(fā)現(xiàn)的擬南芥、水稻、大豆、苜蓿等植物中此家族基因受到非生物脅迫時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的研究結(jié)果是一致的。將該基因在擬南芥中異源表達(dá)和在小麥中過(guò)表達(dá),可以顯著提高擬南芥和小麥的耐鹽性。同時(shí),發(fā)現(xiàn)TaCYP81還可以降低擬南芥對(duì)于過(guò)氧化氫脅迫的敏感性。進(jìn)一步的生理實(shí)驗(yàn)和擬南芥ROS清除酶實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,TaCYP81可以促進(jìn)擬南芥的ROS清除能力,推測(cè)TaCYP81提高小麥和擬南芥的耐鹽性的功能與其促進(jìn)植物ROS清除能力有關(guān),需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。3小麥耐鹽關(guān)鍵基因HKT1；5不同染色體上部分同源基因的進(jìn)化研究在第一部分研究過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)對(duì)TaHKT1;5亞硫酸鹽測(cè)序時(shí)總是可以得到兩個(gè)部分同源的序列樣本,且兩種序列樣本的DNA甲基化狀態(tài)存在顯著性差異,進(jìn)一步從遺傳變異、表觀遺傳變異、表達(dá)差異和蛋白結(jié)構(gòu)功能差異等角度,證實(shí)了小麥不同拷貝HKT1；5基因的不同進(jìn)化命運(yùn)：(1)HKT1；5-A只在小麥二倍體祖先近緣種T.monococcum中存在,也是T.monococcum的耐鹽主效基因,推測(cè)進(jìn)化過(guò)程中由于4AL和5AL的染色體易位等原因而在四倍體小麥和六倍體小麥中丟失；(2)HKT1;5-B1在二倍體小麥祖先種的根中正常表達(dá),進(jìn)化過(guò)程中雖然基因序列幾乎沒(méi)有發(fā)生變化,但是在四倍體小麥和六倍體小麥的根中由于DNA超甲基化而呈現(xiàn)低表達(dá)；(3)HKT1；5-B2在二倍體小麥祖先種的根中正常表達(dá),但是在進(jìn)化過(guò)程中由于啟動(dòng)子區(qū)域的重復(fù)序列插入,而在四倍體小麥和六倍體小麥中呈現(xiàn)超低表達(dá)；(4)HKT1；5-B3在進(jìn)化過(guò)程中由于編碼區(qū)的大片段插入而在四倍體和倍體小麥中成為假基因；(5)HKT1；5-D在六倍體面包小麥中為耐鹽座位Kna1的主效候選基因,其基因序列在二倍體小麥祖先種和六倍體小麥之間幾乎沒(méi)有差異,其表達(dá)量在二倍體小麥祖先種的根中相對(duì)六倍體小麥要高2倍左右,但是HKT1；5-D在根中不受DNA甲基化調(diào)控。通過(guò)3D蛋白結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)和酵母突變體互補(bǔ)實(shí)驗(yàn),證實(shí)HKT1;5-B1也是具有鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能的通道蛋白,轉(zhuǎn)運(yùn)能力略低于TmHKT1;5和TaHKT1;5-D。但是如前所述,HKT1；5-B1在四倍體小麥和六倍體小麥的根中因?yàn)镈NA超甲基化而呈現(xiàn)低量表達(dá),故其在小麥耐鹽性的貢獻(xiàn)上一直沒(méi)有受到重視。通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5.azaC的預(yù)處理四倍體小麥LDN, HKT1;5-B1發(fā)生去甲基化而被誘導(dǎo)表達(dá),進(jìn)一步鹽脅迫表型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HKT1；5-B1的表達(dá)被激活后小麥的耐鹽性得到了一定的提高,葉片中的鈉離子積累程度也得到一定的降低,說(shuō)明HKT1;5-B1如果在根中被激活可以促進(jìn)四倍體小麥的耐鹽性。
【關(guān)鍵詞】：小麥 漸滲系 土壤赫漬化 鹽脅迫 DNA 甲基化 TaCYP81 HKT1 5 部分同源基因 進(jìn)化 異源多倍體化
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S512.1
【目錄】：

• 符號(hào)說(shuō)明6-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-35
• 1.1 小麥13-24
• 1.1.1 六倍體面包小麥的形成13-15
• 1.1.2 小麥研究的常用遺傳材料15-19
• 1.1.3 小麥基因組的研究進(jìn)展19-23
• 1.1.4 全基因組時(shí)代的小麥轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展23
• 1.1.5 小麥多倍體化研究進(jìn)展23-24
• 1.2 植物鹽脅迫應(yīng)答機(jī)制24-31
• 1.2.1 植物鹽脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制25-27
• 1.2.2 植物鹽脅迫應(yīng)答與活性氧的清除27
• 1.2.3 植物細(xì)胞色素450家族基因與植物鹽脅迫應(yīng)答的關(guān)系27-29
• 1.2.4 小麥鹽脅迫應(yīng)答機(jī)制的研究進(jìn)展29-31
• 1.3 表觀遺傳學(xué)31-33
• 1.3.1 DNA甲基化31-32
• 1.3.2 DNA甲基化與植物鹽脅迫應(yīng)答的關(guān)系32
• 1.3.3 DNA甲基化與基因組沖擊的關(guān)系32
• 1.3.4 小麥表觀遺傳學(xué)的研究進(jìn)展與新思路32-33
• 1.4 本研究的目的和意義33-35
• 第二章 小麥漸滲系鹽脅迫應(yīng)答基因的DNA甲基化修飾調(diào)控研究35-66
• 2.1 引言35-36
• 2.2 材料與方法36-39
• 2.2.1 小麥材料及其培養(yǎng)條件、處理?xiàng)l件36
• 2.2.2 擬南芥材料和培養(yǎng)條件36
• 2.2.3 菌株與載體36-37
• 2.2.4 DNA提取,DNA水解和高壓液相色譜法(HPLC)分析37
• 2.2.5 甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性實(shí)驗(yàn)(MSAP)37
• 2.2.6 小麥鹽脅迫應(yīng)答基因的篩選及其cDNA、gDNA和啟動(dòng)子的克隆37-38
• 2.2.7 小麥、擬南芥總RNA的提取和實(shí)時(shí)定量PCR38
• 2.2.8 亞硫酸鹽測(cè)序38
• 2.2.9 擬南芥轉(zhuǎn)化和表型鑒定實(shí)驗(yàn)38
• 2.2.10 亞細(xì)胞定位38
• 2.2.11 MDA含量分析38-39
• 2.2.12 ROS含量分析39
• 2.3 結(jié)果與分析39-61
• 2.3.1 SR3和JN177全基因組水平的甲基化修飾程度比較39-41
• 2.3.2 小麥鹽脅迫應(yīng)答基因的篩選41-42
• 2.3.3 小麥鹽脅迫應(yīng)答基因DNA甲基化修飾水平概況42-44
• 2.3.4 小麥鹽脅迫應(yīng)答基因編碼區(qū)的甲基化狀態(tài)變化與基因表達(dá)變化的關(guān)系44-47
• 2.3.5 小麥鹽脅迫應(yīng)答基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)變化與基因表達(dá)變化的關(guān)系47-51
• 2.3.6 TaFLS1和TaWRSl5在擬南芥中異源表達(dá)可以提高擬南芥的耐鹽性51-53
• 2.3.7 TaCYP81表達(dá)分析53-55
• 2.3.8 TaCYP81的序列分析55-56
• 2.3.9 TaCYP81啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)掃描56-57
• 2.3.10 TaCYP81的亞細(xì)胞定位57-58
• 2.3.11 TaCYP81可以促進(jìn)擬南芥和小麥的耐鹽性58-60
• 2.3.12 TaCYP81可以降低植物對(duì)于過(guò)氧化氫脅迫的敏感度60-61
• 2.4 結(jié)果與展望61-66
• 2.4.1 小麥中DNA甲基化對(duì)于鹽脅迫應(yīng)答基因表達(dá)的調(diào)控作用61-63
• 2.4.2 體細(xì)胞雜交引起的基因組沖擊導(dǎo)致小麥中DNA甲基化的重塑63-64
• 2.4.3 小麥TaCYP81的克隆與耐鹽功能初步研究64-66
• 第三章 小麥耐鹽關(guān)鍵基因HKT1;5不同染色體上部分同源基因的進(jìn)化研究66-80
• 3.1 引言66
• 3.2 材料與方法66-69
• 3.2.1 小麥材料和培養(yǎng)方法66-67
• 3.2.2 小麥不同染色體組TaHKT1；5的克隆67
• 3.2.3 小麥總RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR67-68
• 3.2.4 亞硫酸鹽測(cè)序68
• 3.2.5 MCrBC-qPCR68
• 3.2.6 蛋白結(jié)構(gòu)3D模型的構(gòu)建和分析68
• 3.2.7 TaHKT1；5在酵母突變株中的功能驗(yàn)證68
• 3.2.8 小麥鈉、鉀離子含量測(cè)定68-69
• 3.3 結(jié)果與分析69-78
• 3.3.1 小麥不同拷貝HKT1；5基因的序列分析69-71
• 3.3.2 小麥不同拷貝HKT1；5基因的表達(dá)分析71-73
• 3.3.3 小麥不同拷貝HKT1；5基因的DNA甲基化分析73-74
• 3.3.4 小麥不同拷貝HKT1；5基因之間的表達(dá)調(diào)控74-76
• 3.3.5 小麥HKT1；5-B1和HKT1；5-B2的功能驗(yàn)證76-78
• 3.4 討論與展望78-80
• 3.4.1 小麥不同拷貝HKT1;5基因的進(jìn)化命運(yùn)78
• 3.4.2 通過(guò)調(diào)控HKT1；5-B1的表達(dá)實(shí)現(xiàn)小麥耐鹽性的改良78-80
• 總結(jié)80-82
• 附表82-88
• 參考文獻(xiàn)88-102
• 碩博連讀期間的科研成果102-103
• 致謝103-105
• 附文105-107

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本文編號(hào)：946496