發(fā)布時間：2017-09-29 11:07

  本文關(guān)鍵詞：甘青烏頭生物堿的提取、分離和藥理活性研究

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【摘要】：甘青烏頭為毛茛科烏頭屬植物唐古特烏頭Aconitum tanguticum(Maxim.)Stapf的干燥全草,為高山珍稀藥材,性涼味苦,具有清熱解毒,生肌燥濕的功效,其主要藥效成分為生物堿、苷類、揮發(fā)油等,其中生物堿具有廣泛的藥理活性。采用90%乙醇對甘青烏頭進行提取,得率為17.65%,并用不同極性有機溶劑進行萃取分離,用藥效學技術(shù)方法觀察測定甘青烏頭醇提物(EE)、石油醚萃取部分(PE)、乙酸乙酯萃取部分(EA)、氯仿萃取部分(CH)、正丁醇萃取部分(BU)和水溶性部分(WA)對非特異性急、慢性炎癥反應(yīng)的影響,測定EE、PE、EA、CH、BU和WA對冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)和熱刺激痛閾的影響,比較分析其抗炎鎮(zhèn)痛作用;研究發(fā)現(xiàn)甘青烏頭具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛作用,醇提物具有較強的抗炎鎮(zhèn)痛活性,初步篩選發(fā)現(xiàn)氯仿萃取部位是抗炎鎮(zhèn)痛的主要藥效物質(zhì)群,其他部位亦具有一定的抗炎鎮(zhèn)痛活性,相對較弱。根據(jù)甘青烏頭抗炎鎮(zhèn)痛作用的藥效物質(zhì)主要集中在醇提物的氯仿萃取部位,并且發(fā)現(xiàn)含有生物堿,于是對甘青烏頭的總生物堿(TAA)進行提取,并對TAA進行定性定量分析和質(zhì)量評價結(jié)果顯示含生物堿(以烏頭堿計)為0.3323%,建立了比較穩(wěn)定的TAA含量測定方法,并采用Box-Behnken Design設(shè)計實驗方案,以總生物堿和酯型生物堿含量為指標,在單因素試驗基礎(chǔ)上,優(yōu)選TAA的提取工藝,獲得最佳工藝條件為提取溫度85℃,提取時間1.5h,乙醇質(zhì)量分數(shù)90%,液料比15:1,該工藝條件下TAA和酯型生物堿含量分別為0.5360g/100g提取物和0.5030μg/mg總堿,且重現(xiàn)性好,可作為TAA提取的新工藝。選擇兩種給藥途徑研究TAA對小鼠灌胃和腹腔注射時的急性毒性,并測定LD50,初步評價其安全性,研究發(fā)現(xiàn)TAA灌胃給藥的LD50為0.7456g/kg,TAA腹腔注射給藥的LD50為0.3358g/kg,研究證實TAA經(jīng)灌胃和腹腔注射對小鼠均具有一定的急性毒性,初步判斷TAA急性中毒的靶器官為植物神經(jīng)系統(tǒng)和運動神經(jīng)系統(tǒng),中毒較快,持續(xù)時間較短。進一步藥效學研究發(fā)現(xiàn)TAA對非特異性急性炎癥反應(yīng)和慢性炎癥性組織增生具有明顯抑制作用,也具有一定的鎮(zhèn)痛作用。采用脂多糖(LPS)誘導建立大鼠急性肺損傷(ALI)模型,研究TAA對ALI模型大鼠的治療作用及作用機制,結(jié)果表明TAA通過其抗炎活性保護肺功能,且無顯著的肺組織細胞毒性,TAA對LPS誘導的ALI的保護作用是通過改善肺組織病理變化,抑制NF-кB活化,減少炎性細胞浸潤、血管滲出等實現(xiàn)的,結(jié)果顯示抑制前炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-кB以及炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6和IL-1β是主要的作用機制,初步表明TAA可作為急性肺損傷的有效治療物質(zhì)。采用甲氨蝶呤誘導建立大鼠急性出血性腸炎(AHE)模型,研究TAA對AHE模型大鼠的治療作用及作用機制,研究發(fā)現(xiàn)TAA灌胃后能明顯改善AHE模型大鼠的一般狀況,改善組織形態(tài),降低血清TNF-α和NO含量,上調(diào)回腸組織勻漿DAO、ICAM-1和MPO水平,表明TAA可有效保護腸黏膜的機械屏障,具有良好的抗炎作用,初步表明TAA可作為急性腸炎的有效治療物質(zhì)。選擇常見致病菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),糞腸球菌(Enterococcus faecalis)和白色念珠菌(Candida albicans)為研究對象進行抗菌試驗,研究發(fā)現(xiàn)TAA對G+菌及G-菌抗菌活性較強,而對真菌在1.0~10.0mg/m L范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯的抑制作用,TAA對金黃色葡萄球菌的抗菌效價最高,對大腸桿菌的效價最低。體外抗炎研究結(jié)果顯示,TAA可抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞釋放NO和IL-1,有效減輕炎癥損傷,TAA在60-240mg/L范圍內(nèi)亦能明顯增強巨噬細胞的吞噬功能,結(jié)果進一步證明TAA有較強的抗炎作用。
【關(guān)鍵詞】：甘青烏頭 總生物堿 抗炎鎮(zhèn)痛 急性肺損傷 出血性腸炎
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S853.7
【目錄】：

• 附件3-6
• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 英文縮略表14-15
• 第一章 引言15-22
• 1.1 甘青烏頭的資源研究15-16
• 1.1.1 生長環(huán)境15
• 1.1.2 植物性狀15-16
• 1.1.3 資源利用16
• 1.2 甘青烏頭的化學研究16-19
• 1.2.1 生物堿16-18
• 1.2.2 揮發(fā)油18-19
• 1.2.3 多糖19
• 1.2.4 苷類19
• 1.3 甘青烏頭的藥理研究19-20
• 1.3.1 抗菌19
• 1.3.2 抗炎19
• 1.3.3 抗病毒19
• 1.3.4 抗腫瘤19-20
• 1.3.5 對心血管的作用20
• 1.4 甘青烏頭的臨床應(yīng)用20-22
• 第二章 甘青烏頭抗炎鎮(zhèn)痛活性追蹤研究22-28
• 2.1 實驗材料22-23
• 2.1.1 藥品與試劑22
• 2.1.2 實驗動物22
• 2.1.3 主要儀器22-23
• 2.2 方法與結(jié)果23-26
• 2.2.1 甘青烏頭化學成分的提取與粗分離23-24
• 2.2.2 甘青烏頭粗分離部位抗炎作用24-25
• 2.2.3 甘青烏頭粗分離部位鎮(zhèn)痛作用25-26
• 2.3 討論26-28
• 第三章 甘青烏頭總生物堿的提取方法研究28-51
• 3.1 實驗材料28
• 3.1.1 藥品與試劑28
• 3.1.2 儀器與設(shè)備28
• 3.2 方法與結(jié)果28-48
• 3.2.1 甘青烏頭總生物堿的提取及測定28-31
• 3.2.2 HPLC法測定甘青烏頭酯型生物堿含量的方法31-38
• 3.2.3 單因素試驗考察甘青烏頭總生物堿和酯型生物堿的提取條件38-42
• 3.2.4 甘青烏頭總生物堿和酯型生物堿提取條件的響應(yīng)面分析42-48
• 3.2.5 甘青烏頭總生物堿提取條件的響應(yīng)面分析結(jié)果驗證48
• 3.3 討論48-51
• 第四章 甘青烏頭總生物堿急性毒性和抗炎鎮(zhèn)痛作用51-58
• 4.1 實驗材料51
• 4.1.1 藥品與試劑51
• 4.1.2 實驗動物51
• 4.1.3 主要儀器51
• 4.2 方法與結(jié)果51-56
• 4.2.1 甘青烏頭總生物堿急性毒性51-53
• 4.2.2 甘青烏頭總生物堿抗炎作用53-55
• 4.2.3 甘青烏頭總生物堿鎮(zhèn)痛作用55-56
• 4.3 討論56-58
• 第五章 甘青烏頭總生物堿對急性肺損傷的保護作用58-73
• 5.1 實驗材料58-59
• 5.1.1 實驗動物58
• 5.1.2 藥品與試劑58-59
• 5.1.3 主要儀器59
• 5.2 方法59-61
• 5.2.1 分組、造模與給藥59
• 5.2.2 指標與檢測方法59-61
• 5.3 結(jié)果61-71
• 5.3.1 對ALI大鼠肺氣體交換功能的影響61-62
• 5.3.2 對ALI大鼠肺水腫的影響62-63
• 5.3.3 對ALI大鼠BALF蛋白含量的影響63
• 5.3.4 對ALI大鼠BALF細胞數(shù)的影響63-65
• 5.3.5 對ALI大鼠肺組織MPO活性和MDA含量的影響65-66
• 5.3.6 對ALI大鼠BALF細胞炎癥因子的影響66-68
• 5.3.7 對ALI大鼠肺組織形態(tài)學的影響68-70
• 5.3.8 對ALI大鼠肺組織NF-ΚB表達的影響70-71
• 5.4 討論71-73
• 第六章 甘青烏頭總生物堿對大鼠出血性腸炎的保護作用73-87
• 6.1 實驗材料73-74
• 6.1.1 實驗動物73
• 6.1.2 藥品與試劑73-74
• 6.1.3 主要儀器74
• 6.2 方法74-75
• 6.2.1 造模、分組與給藥74
• 6.2.2 指標與檢測方法74-75
• 6.2.3 統(tǒng)計學方法75
• 6.3 結(jié)果75-85
• 6.3.1 對大鼠一般狀況的影響75-77
• 6.3.2 對AHE大鼠血清炎癥因子TNF-A和NO的影響77-78
• 6.3.3 對AHE大鼠腸組織形態(tài)學影響78-82
• 6.3.4 對AHE大鼠腸組織勻漿DAO含量和MPO活性的影響82-83
• 6.3.5 對AHE大鼠腸ICAM-1 表達的影響83-85
• 6.4 討論85-87
• 第七章 甘青烏頭總生物堿的體外抗炎和抗菌活性87-94
• 7.1 實驗材料87-88
• 7.1.1 藥品與試劑87
• 7.1.2 實驗動物87
• 7.1.3 主要儀器87-88
• 7.1.4 供試菌株88
• 7.2 方法88-89
• 7.2.1 對小鼠腹腔巨噬細胞的細胞毒作用88
• 7.2.2 對LPS刺激小鼠腹腔巨噬細胞釋放NO的影響88
• 7.2.3 對LPS刺激小鼠腹腔巨噬細胞釋放IL-1 的影響88-89
• 7.2.4 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響89
• 7.2.5 抑菌圈測定89
• 7.2.6 最小抑菌濃度和半數(shù)抑菌濃度的測定89
• 7.3 結(jié)果89-93
• 7.3.1 對小鼠腹腔巨噬細胞的細胞毒作用89-90
• 7.3.2 對LPS刺激小鼠腹腔巨噬細胞釋放NO和IL-1 的影響90-91
• 7.3.3 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響91
• 7.3.4 抑菌圈測定結(jié)果91
• 7.3.5 TAA的MIC和MIC_(50)91-93
• 7.4 討論93-94
• 第八章 全文結(jié)論94-95
• 參考文獻95-105
• 致謝105-106
• 作者簡歷106

【參考文獻】

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本文編號：941639